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RACE 反转录求助 已有1人参与
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本人大三学生，等着实验结果写论文申请出国…… 现在卡在RACE上。 提取的mRNA经过1%琼脂糖电泳检验，结果是有两条亮带，很少降解。 然后反转录上有以个问题： 隔壁实验室给的两个接头引物BOD（3‘端有GGG的）和AOLP（3’端有poly T的），然后用的反转录试剂盒是Promega的A5000 根据说明书，采用以下操作： totalRNA 5μg AOLP 1ug 无核苷酸水（试剂盒提供） 补全到5ul 70℃ 预变性（应该是这样的目的） 5 min后立即冰浴5 min，然后任意速度离心10 s（没有写出速度要求，通常用7500 rpm） 反应体系配制： 5X 的Reaction Buffer 40 ul MgCl2 （听说Mg越多杂带越少。但是扩增的条带越不亮） 4 ul PCR Nucleotide Mix 10 ul RRI 0.5 ul 反转录酶（GoScript Recerse Transcriptase） 10 ul BDO 1 ul 用提供的Water调制 15 .0ul 冰上混合变性的RNA和反应体系 25℃ 5min 42℃ 1h 70℃ 15min 现在问题是，隔壁实验室给的体系和我买的体系稍有不同， 他们用37℃（DNase Buffer、RQ DNase，RRI，RNA和水配制成体系）处理后用加 AOLP和stop solution 70℃孵育（ 终止延伸用，说让后来的BOD结合上去） 然后在进行第一链cNDA合成，这时候才加BDO。 不知道以我的那种方法来做能不能达到同样的效果。就在在反转录的时候在5‘端加上BDO序列。 求助求助！！！ |
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3楼2015-11-02 22:40:52
zhangyao7255
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