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hhedu-ny

木虫 (著名写手)

[交流] 关于半定量PCR问题

最近在做半定量PCR,没接触过这方面的,老师突然让做这个,有个疑问,就是想问问各位大神就是跑出来之后Ct的数据该怎么处理啊,我是每个基因四个复孔,我是把目的基因和内参基因的四个值取平均(如果SD大舍去一个)算的,采用2(-ΔΔCt)法,结果就是最后每组浓度对应的各个目的基因就只都有一个值,我想知道最后画图文献里的误差棒是什么SD,是最后算出来的倍数的SD,还是ΔΔCt或ΔCt的SD值呢?希望个人虫友了解的给普及一下,在下感激不尽。。。
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路慢慢其修远兮~
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hhedu-ny

木虫 (著名写手)

没人回。。。
路慢慢其修远兮~
8楼2015-08-04 20:54:48
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kongzi183

银虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
hhedu-ny: 金币+4 2015-08-05 09:38:28
你这已经不是半定量了。。。看这算法这已经是相对定量。还有,四个复孔,这个的取舍要看溶解曲线,我虽然没做过几次,但是有个老师做给我看,我还记得,是在溶解曲线界面就把波动太大的舍去,不一定算平均值每个样本的重复都一样。另外,我有个相对定量的Excel表格,天亮去实验室看能不能发给你,以前有师姐给的。把自己的数值粘进入,一拖就出来了。(我本科毕业论文用到这个相对定量pcr,可是学的不太深,现在还没做这方面的也没再仔细学过,只能帮你这么点了)

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11楼2015-08-05 02:45:00
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kongzi183

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
另外,溶解曲线那个界面非常重要,也能看你设计的引物能不能用。如果大的波峰前边有小波峰。好像在八十之前有波峰就要注意了,引物可能不能用,(筛引物)。再有,我理解的半定量是跑完胶,用灰度软件分析,可是这个十分不准。也就能在紫外或蓝光下看看条带亮度,这么定性分析哪个表达量多少

[ 发自小木虫客户端 ]
12楼2015-08-05 02:49:52
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
hhedu-ny: 金币+2 2015-08-05 10:25:06
首先通过你的描述,你做的是定量PCR(real-time PCR,或称qPCR)而不是半定量PCR(semi-PCR)。
其次你没有弄懂Ct值和基因表达值的定义——你看看相关文献real-time PCR图的纵坐标就知道SD是表达水平的标准差。
...
日拱一卒,功不唐捐
13楼2015-08-05 08:13:20
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