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Mike6514

新虫 (初入文坛)

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虫号: 3171096
注册: 2014-04-29
专业: 病原真菌学

[求助] RNAiso plus法提取构巢曲霉RNA 已有1人参与

各位大神求帮帮忙吧，提了快一个月的RNA了，用的是RNAiso plus法，提构巢曲霉的RNA,一直没有提出来过，我先说说我的试剂吧：
（1）RNAiso PLUS
（2）氯仿
（3）异丙醇
（4）75%乙醇（DEPC处理水配制）
（5） RNase-free水（用DEPC水替代）
（6）5mol/L的Nacl溶液和高盐溶液（0.8mol/L的柠檬酸钠和1.2mol/L的Nacl）
实验所用1.5ml离心管，枪头用都用0.1% DEPC水浸泡后于120℃下高压灭菌20分钟以除去残留的DEPC。实验操作过程中带一次性手套，在超净工作台进行，操作过程全程避免说话。
实验操作：
1、将构巢曲霉接种到铺有玻璃纸的PDA培养基上，28℃培养3d。
2.、用无菌的镊子刮取菌丝，称取0.2g菌丝体于研钵中，用经过液氮预冷的杵子充分研磨，直至菌丝成粉末状，立即进行RNA抽提。
3、将粉末迅速转移至加有1 ml TRIZOL 的2.0 ml离心管中，震荡混匀，室温下静置5分钟。
4、加入0.25 ml氯仿和0.25ml的5mol/L的Nacl溶液，剧烈震荡混匀后，室温下静置5分钟。
5、4℃、12000 r/min离心10min
6、取上清，至另一2.0 ml离心管中，加入等体积的异丙醇和等体积的高盐溶液，（以后操作在冰上进行）颠倒离心管数次混匀，-20℃放置15 min沉淀RNA。
7、4℃、12000 r/min离心10min
8、弃上清，加入75％乙醇1 ml洗涤沉淀（1-2次）。
9、4℃、12000 r/min离心5min
10、弃上清，将离心管置于超净台上自然挥干5 -8min。
11、加入无RNase的双蒸水20ul，55~60℃放置10min，溶解RNA，一70℃储存备用。
实验结果图（RNA的0.8%的琼脂糖凝胶跑胶25min）:
做了五六次，提出的RNA都是这个结果，很是郁闷，求大神指点

RNA的0.8%的琼脂糖凝胶跑胶25min.jpg

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