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douglaspei

金虫 (正式写手)

[求助] WB实验有非特异结合已有1人参与

今天做的WB实验，泳道里有很多非特异结合，请高手指教。

WB实验有非特异结合
C,27Q,28E,MS,29L,29T,33K,44E,MS,46T,46V,56S,61R,64P,72W-150516A.jpg


WB实验有非特异结合-1
C,27Q,28E,MS,29L,29T,33K,44E,MS,46T,46V,56S,61R,64P,72W-150516B.jpg
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1楼2015-05-16 17:49:46
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zhsina123

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
douglaspei: 金币+1, ★有帮助 2015-05-21 14:33:57
个人觉得可以考虑几个问题：
一抗孵育后，是否已经使用TBST充分洗脱？
一抗的特异性如何？是多抗还是单抗？
二抗杂交后是否洗脱充分？

看到膜上有许多泡泡，转膜时应该赶去泡泡，避免气泡阻碍蛋白转膜。
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2楼2015-05-16 18:33:21
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douglaspei

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhsina123 at 2015-05-16 18:33:21
个人觉得可以考虑几个问题：
一抗孵育后，是否已经使用TBST充分洗脱？
一抗的特异性如何？是多抗还是单抗？
二抗杂交后是否洗脱充分？

看到膜上有许多泡泡，转膜时应该赶去泡泡，避免气泡阻碍蛋白转膜。

谢谢您的回复，
1. 我用的是金斯瑞的试剂盒，在一抗与目的蛋白结合前，先孵育一抗和二抗。
2. 一抗之前做过，特异性还不错。
3. 抗体孵育后洗的比较充分，只有两张膜叠在一块洗的，如果有影响也应该是下面那一张。
4. 试剂盒过期两周了，个人觉得是不是封闭液坏了，导致抗体与所有蛋白结合。
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3楼2015-05-17 13:04:04
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douglaspei

金虫 (正式写手)
另外，在半干转的过程中，将电泳后的胶向膜上转移时，容易弄碎胶，且不易与膜对整，不知道没有没什么好的方法，谢谢！
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4楼2015-05-17 13:13:49
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