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高效液相色谱求助 已有2人参与
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作液相色谱分析，流速1ml/min，流动相甲醇，样品用无水甲醇（AR）溶解的，进样浓度为20mg/ml，进样体积为20ul，DAD检测器，吸收波长为263nm，谱带宽度为4nm，不设参比波长，温度30℃，色谱图如下。Agilent 1100液相色谱仪，手动进样。 求教：（1）大峰的拖尾因子为1.26，是否恰当，需不需要改进？ （2）图中几个色谱峰距离较近，是否恰当，需不需要改进？ （3）样品是否要改用流动相甲醇（色谱级）来溶解？ （4）进样浓度是否恰当？ 小弟初涉液相色谱，烦请各位指教。谢谢！！！！  色谱图.jpg  色谱放大图.jpg |
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tuzilanlan
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5楼2015-09-10 20:56:27
xuanchenzi2004
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【答案】应助回帖
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孔雀王: 金币+4, ★有帮助 2015-05-10 23:26:29
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孔雀王: 金币+4, ★有帮助 2015-05-10 23:26:29
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作液相色谱分析，流速1ml/min，流动相甲醇，样品用无水甲醇（AR）溶解的，进样浓度为20mg/ml，进样体积为20ul，DAD检测器，吸收波长为263nm，谱带宽度为4nm，不设参比波长，温度30℃，色谱图如下。Agilent 1100液相色谱仪，手动进样。 求教：（1）大峰的拖尾因子为1.26，是否恰当，需不需要改进？ 建议改进，按照EP要求为0.8-1.5，你这个有优化空间：in a related substances test or assay, for a peak in the chromatogram obtained with a reference solution used for quantification, the symmetry factor is 0.8 to 1.5, unless otherwise prescribed; （2）图中几个色谱峰距离较近，是否恰当，需不需要改进？ 建议改进。 （3）样品是否要改用流动相甲醇（色谱级）来溶解？ 不需要，用分析级别即可。如果可以水溶，优先考虑加入适量水，防止溶剂效应。 （4）进样浓度是否恰当？ 进样量可以降低，10ul试试。 |
2楼2015-04-30 16:45:15
3楼2015-04-30 17:41:46
ufoking
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【答案】应助回帖
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archbishop: 金币+3, 感谢参与。 2015-05-01 11:21:40
孔雀王: 金币+6, ★★★很有帮助 2015-05-10 23:26:40
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孔雀王: 金币+6, ★★★很有帮助 2015-05-10 23:26:40
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（1）造成峰拖尾的原因很多，罗列一下我所知道的： 1进样体积太大或者浓度太高：最常见的造成拖尾的原因，解决办法就是稀释样品或者减少进样量； 2分析物和色谱柱间的次级作用：在反相体系中，若分析酸性化合物时应在柱子pH耐受范围内降低流动相的pH使酸质子化，比如添加0.1%的TFA；若分析碱性化合物时可添加TEA作为减尾剂，同时提高pH，也可考虑提高缓冲盐浓度抑制离子化； 3如果刚开始摸好的条件没问题，一段时间后出现拖尾的现象则可能是色谱柱污染或者保护柱失效：解决办法是用比流动相更强极性的溶剂冲洗色谱柱，并且更换保护柱；如果还是不行说明色谱柱柱效已经严重下降，亦或是键合相流失甚至引发色谱柱塌陷；这种情况峰多的时候能够明显观察到，每个峰都有严重的拖尾； 4如果刚开始摸条件，并且色谱柱是新的，出现拖尾可能是管线连接不好造成柱外死体积过大； 5还有一种情况比较会让人忽视，就是假拖尾，真正的原因是两个峰靠得太近没分开； （2）色谱峰靠得近，可能是浓度太高或者进样量过大导致，建议稀释样品，减少进样体积；如果不行就需要优化流动相及梯度洗脱程序，必要的话需添加缓冲盐。实在不行的话试试添加离子对试剂，但此法不到万不得已不要用； （4）改不了进样量就稀释样品，但要保证稀释后的样品与流动相要很好的互溶，否则容易出现基线漂移和鬼峰的出现。 |
4楼2015-05-01 01:23:52
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