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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！
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yejunhong

铜虫 (初入文坛)

[交流] 新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！

最近好不容易表达出蛋白，进入纯化。载体用的pET-32a，有his标签，前几天第一次摇了500ml，尝试挂了ni柱。洗脱下来后跑了电泳。结果如下：新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！
 \"新人第一帖，关于原核表达蛋白后，纯化策略问题。希望大神帮助！谢谢！-1\"
蛋白泳道从左到右依次是：1.M  2.破碎后蛋白上清原液  3.流穿  4.洗脱  5-10分别是20,50,100,200,500mM以及1M咪唑洗脱
maker 从上到下分别是116,66,45,35,25,18,14.
可以看到在50和100mM咪唑浓度时，我的蛋白有被大量洗脱下来。
但是现在问题来了，染色之后虽然我的蛋白条带比较明显，但是杂蛋白感觉也不少。洗脱和20mM浓度时都没有冲下来很多杂蛋白。
最近收了大量的蛋白。过柱子的话，我是不是应该用20mM咪唑多洗几个柱体积？或者在50mM多洗，希望100mM时就能得到较纯的蛋白？
我也想过用分子筛，但是50,100mM泳道的杂蛋白和表达蛋白好像分子量差别不大，分子筛是不是不容易分开呢？
又或者用离子交换或者其他？希望各位能够帮我分析一下。谢谢各位！
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1楼 2015-04-23 10:46:53
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
★ ★
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yejunhong: 金币+1 2015-04-27 22:18:26
你是洗了多少体积啊，洗出来的条带还没有上清那么明显，像这种情况，有条件直接过一个分子筛看结果，大多都能解决。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2015-04-26 02:46:15
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yejunhong: 金币+2 2015-04-25 10:30:21
本帖内容被屏蔽
2楼2015-04-24 21:19:02
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yejunhong

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mataomatao at 2015-04-24 21:19:02
脱盐之后再次挂柱，之后在0-20拉个咪唑梯度

用0-20拉梯度？请问怎么设置这个梯度啊？
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3楼2015-04-25 10:31:04
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
4楼2015-04-25 11:39:13
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