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蛋白纯化问题，过一次镍柱，又过一次DEAE后依然有杂带，该如何进一步纯化？已有3人参与
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目的蛋白大约60多KDa，pI=4.7，BL21中表达 过完His亲和层析后有两条杂带，再过一次DEAE弱阴离子交换，pH7.0 梯度洗脱 跑电泳显示目的条带下依然有杂带，求助该如何进一步纯化？ 左一，过完镍柱样品 左二，过DEAE后样品  IMG_20150319_134001_副本.jpg |
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pennchem
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【答案】应助回帖
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建议你： 1.先过DEAE，在过镍柱，因亲和的分辨率肯定比离子交换的要高。 2.优化你两次层析的过程。比如DEAE用PH7的缓冲液加盐梯度洗脱是，梯度上升的慢一些，当然不确定你怎么拉的梯度，比去是从20mm-1M你之前用1个小时浓度增加到1M，那你可以优化成2个小时或3个小时。若不是连续梯度，可以梯度拉的更细一些。 3.然后DEAE的目标蛋白洗脱峰除盐，交换缓冲液在上上NI柱，上镍住时可以少量的上样缓冲液及平衡缓冲液中加一些咪唑，比如20mm，在加一定量的盐，比如200mm，目前是为了减少特异性吸附。然后洗脱和DEAE一样啊，咪唑梯度也分的在细一些。 祝顺利。 |
7楼2015-08-29 21:08:49