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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 怎么才能把WB的内参调齐啊？大家交流一下。
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露的想念

新虫 (小有名气)

[求助] 怎么才能把WB的内参调齐啊？大家交流一下。 已有2人参与

RT: 我是收完样品之后，离心取上清，然后用BCA测浓度，之后使每个样品的体积和浓度一样，浓度大的用PBS补齐，加入相同体积的loading buffer，95度煮样10min，我觉得我的方法没问题啊？但是每次跑出来ACTIN 都不齐，很明显，感觉很奇怪，难道是手法有问题，大家帮我分析分析吧！多谢！
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1楼 2015-03-28 21:12:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

DIANDIAN12

铜虫 (初入文坛)
我有一段时间也是Actin不齐，后来发现原因是整组样品的蛋白浓度差太多了，BCA调节浓度的时候误差就比较大，所以即使理论上将浓度都调到2，但实际上还是有差别的。后来，我就调两次，先BCA测定浓度，然后粗调到2，再BCA重测，这次才是细调，这样子Actin才齐了。
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16楼2015-05-02 13:37:06
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chenzq1993

新虫 (初入文坛)
计算出来多大浓度就是多大浓度
按照同质量上样，     这样每个样上样体积是不同的
先跑一次，根据结果再微调
你也能看出  不同体积之间差别有多大
多做几次   就有经验了
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15楼2015-04-14 10:36:21
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普通回帖

sdu_max

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两块胶。😁

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-03-28 23:11:34
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SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
露的想念: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-03-29 13:51:39
如果你选择生长情况相同的细胞，无需测浓度，加相同体积的buffer以后直接煮样品就可以了。
如果你表达某些影响细胞生长的基因，你可以做一次不同梯度稀释队的western摸一下条件。例如我表达一个与细胞死亡相关的细胞时候，我会适当增加WT的buffer量，稀释WT细胞，达到平衡
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3楼2015-03-29 12:37:28
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露的想念

新虫 (小有名气)
但是觉得自己种的板子，不是特别匀，这样直接加buffer煮样，actin肯定不齐啊，目的基因没法比较，不太懂你们的意思啊
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4楼2015-03-29 13:21:25
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 12:37:28
如果你选择生长情况相同的细胞，无需测浓度，加相同体积的buffer以后直接煮样品就可以了。
如果你表达某些影响细胞生长的基因，你可以做一次不同梯度稀释队的western摸一下条件。例如我表达一个与细胞死亡相关的细 ...

但是觉得自己种的板子，不是特别匀，这样直接加buffer煮样，actin肯定不齐啊，目的基因没法比较，不太懂你们的意思啊
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5楼2015-03-29 13:21:46
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sdu_max at 2015-03-28 23:11:34
两块胶。😁

你是说跑两块胶，比较一下吗？你们是怎么调齐的啊
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6楼2015-03-29 13:22:29
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SAM001

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 露的想念 at 2015-03-29 13:21:46
但是觉得自己种的板子，不是特别匀，这样直接加buffer煮样，actin肯定不齐啊，目的基因没法比较，不太懂你们的意思啊...

你要是western做的板子都弄不匀那还做什么western呢，我建议你先多学习一下制备胶的办法。我自己这样做从来都没有内参问题
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7楼2015-03-29 13:24:41
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 13:24:41
你要是western做的板子都弄不匀那还做什么western呢，我建议你先多学习一下制备胶的办法。我自己这样做从来都没有内参问题...

我种的是中皿，我觉得都很难种匀吧，能使每个蛋白的浓度时一样的，难道你每次actin都是齐的？
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8楼2015-03-29 13:35:36
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SAM001

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 露的想念 at 2015-03-29 13:35:36
我种的是中皿，我觉得都很难种匀吧，能使每个蛋白的浓度时一样的，难道你每次actin都是齐的？...

我不知道中皿是什么意思i，但是我的actin每次都是齐的。前提是控制好细胞量
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9楼2015-03-29 13:42:46
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 13:42:46
我不知道中皿是什么意思i，但是我的actin每次都是齐的。前提是控制好细胞量...

就是比六孔板稍微大一些的皿，那你每次调每个样品的浓度为一致吗？你是怎么控制细胞量的？能不能交流下，每次调个actin 头都大
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10楼2015-03-29 13:47:07
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