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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 怎么才能把WB的内参调齐啊？大家交流一下。
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)
这个问题是非常常见的，就算在实验室专业做WESTERN的人员，也会遇到内参不齐的问题。单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。在就是抗体孵育问题，不知你是用孵育盒，还是用封膜孵育，一定要保证膜与抗体充分接触，保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的，注意混合比例，祝楼主早日跑出理想的条带。
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11楼2015-03-29 13:58:19
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhenwuhuang at 2015-03-29 13:58:19
这个问题是非常常见的，就算在实验室专业做WESTERN的人员，也会遇到内参不齐的问题。单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在 ...

请问您们是怎么调齐蛋白浓度呢？怎么才能确定胶配的不均匀呢？我一般是用移液器吹几下，而且我的浓缩胶是每个板子3ml，是不是浓缩胶加的太多了呢？期待您的解答.
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12楼2015-03-29 14:03:15
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SAM001

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 露的想念 at 2015-03-29 13:47:07
就是比六孔板稍微大一些的皿，那你每次调每个样品的浓度为一致吗？你是怎么控制细胞量的？能不能交流下，每次调个actin 头都大...

我用六孔板，15X15cm的版都做过了。没有你所说的问题。
15X15cm那一次我是一个对照，一个是过表达毒蛋白的细胞。我师兄告诉我，由于蛋白有毒那盘细胞的量大概是对照的80%于是我根据量自己调了一下稀释浓度
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13楼2015-03-29 15:25:46
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 15:25:46
我用六孔板，15X15cm的版都做过了。没有你所说的问题。
15X15cm那一次我是一个对照，一个是过表达毒蛋白的细胞。我师兄告诉我，由于蛋白有毒那盘细胞的量大概是对照的80%于是我根据量自己调了一下稀释浓度...

可能是我板子种的不匀，但是就算不匀，我一步步调浓度也没错误吧，但是每次我跑12个样品孔时，actin就是不齐，我想请教你是怎么调的？
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14楼2015-03-29 21:44:21
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chenzq1993

新虫 (初入文坛)
计算出来多大浓度就是多大浓度
按照同质量上样，     这样每个样上样体积是不同的
先跑一次，根据结果再微调
你也能看出  不同体积之间差别有多大
多做几次   就有经验了
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15楼2015-04-14 10:36:21
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DIANDIAN12

铜虫 (初入文坛)
我有一段时间也是Actin不齐，后来发现原因是整组样品的蛋白浓度差太多了，BCA调节浓度的时候误差就比较大，所以即使理论上将浓度都调到2，但实际上还是有差别的。后来，我就调两次，先BCA测定浓度，然后粗调到2，再BCA重测，这次才是细调，这样子Actin才齐了。
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16楼2015-05-02 13:37:06
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hellangel1

木虫 (初入文坛)
可以调整一下加样的量，把actin调齐

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17楼2015-05-03 00:21:53
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