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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 怎么才能把WB的内参调齐啊？大家交流一下。
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露的想念

新虫 (小有名气)

[求助] 怎么才能把WB的内参调齐啊？大家交流一下。 已有2人参与

RT: 我是收完样品之后，离心取上清，然后用BCA测浓度，之后使每个样品的体积和浓度一样，浓度大的用PBS补齐，加入相同体积的loading buffer，95度煮样10min，我觉得我的方法没问题啊？但是每次跑出来ACTIN 都不齐，很明显，感觉很奇怪，难道是手法有问题，大家帮我分析分析吧！多谢！
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1楼 2015-03-28 21:12:27
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)
这个问题是非常常见的，就算在实验室专业做WESTERN的人员，也会遇到内参不齐的问题。单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。在就是抗体孵育问题，不知你是用孵育盒，还是用封膜孵育，一定要保证膜与抗体充分接触，保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的，注意混合比例，祝楼主早日跑出理想的条带。
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11楼2015-03-29 13:58:19
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sdu_max

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两块胶。😁

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-03-28 23:11:34
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SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
露的想念: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-03-29 13:51:39
如果你选择生长情况相同的细胞，无需测浓度，加相同体积的buffer以后直接煮样品就可以了。
如果你表达某些影响细胞生长的基因，你可以做一次不同梯度稀释队的western摸一下条件。例如我表达一个与细胞死亡相关的细胞时候，我会适当增加WT的buffer量，稀释WT细胞，达到平衡
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3楼2015-03-29 12:37:28
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露的想念

新虫 (小有名气)
但是觉得自己种的板子，不是特别匀，这样直接加buffer煮样，actin肯定不齐啊，目的基因没法比较，不太懂你们的意思啊
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4楼2015-03-29 13:21:25
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