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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 紧急求助：用凝血酶切GST时，但目标蛋白短时间内被降解，怎么回事？
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小馒头来学习

新虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助：用凝血酶切GST时，但目标蛋白短时间内被降解，怎么回事？ 已有1人参与

本人利用gst标签纯化处一种蛋白，但过完亲和柱后在用凝血酶切标签时，短时间（1.5h）内目标蛋白（42KD左右）被降解，这期间gst标签也会被正常切下。跑变性电泳，只会得到标签（27KD）条带和标签下的一条带，但用凝胶色谱柱分离时，第一个峰对应的是下面的条带，第二个峰对应的才是GST标签，酶切条件是25摄氏度，80rmp。望各位大神给予帮助分析分析原因，初来报到，金币有限，在此献出全部家当寻求帮助，拜托拜托.......
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1楼 2015-03-18 21:25:59
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小馒头来学习

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-03-19 02:18:12
你确定是降解了, 不是沉淀了？
有的蛋白溶解性不好，GST可以帮助溶解，但是一旦切掉GST，蛋白就会聚集沉淀
你把酶切混合物离心，然后直接用laemmli dye溶解底部的那一点，然后跑胶看看目标蛋白是不是在里面

谢谢您的解答。但我不明白的是，这样说的话，那我接的凝胶柱出的第一个峰处的蛋白溶液应该是聚集后的目标蛋白，但做变形电泳也看不到目标条带，是怎么回事？
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3楼2015-03-19 10:03:33
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确定是降解了, 不是沉淀了？
有的蛋白溶解性不好，GST可以帮助溶解，但是一旦切掉GST，蛋白就会聚集沉淀
你把酶切混合物离心，然后直接用laemmli dye溶解底部的那一点，然后跑胶看看目标蛋白是不是在里面
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2015-03-19 02:18:12
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小馒头来学习

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-03-19 02:18:12
你确定是降解了, 不是沉淀了？
有的蛋白溶解性不好，GST可以帮助溶解，但是一旦切掉GST，蛋白就会聚集沉淀
你把酶切混合物离心，然后直接用laemmli dye溶解底部的那一点，然后跑胶看看目标蛋白是不是在里面

您说的这个我先试试，，谢了哈....
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4楼2015-03-19 10:05:35
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