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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 温度梯度相关问题
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iuipig

新虫 (初入文坛)

[求助] 温度梯度相关问题 已有4人参与

本人最近在摸索几对引物的最适退火温度，用来做相对定量pcr。
在摸索的过程中出现这样的情况：目的条带大约200bp左右，都是没有出现，过着出现很淡，而在100bp附近（以下）出现条带，还会随着不同的温度亮度发生变化，很不解。设置的阴性对照（dd水为模板，引物和实验组一样），没有出现这样的条带。感觉又不能用引物二聚体解释。分别跑了1.5%和3%的胶，用D2000为marker。结果如下图。
这个是1.5%的胶 \"温度梯度相关问题\"
这个是3%的胶 \"温度梯度相关问题-1\"
哪位大神请教了！！！
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1楼 2015-02-06 00:38:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
怎么看不了图呢？
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-02-06 08:48:14
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linxiqi

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我师哥说，要找到退火的最适温度就采用降落PCR，如果酶好的话，一般都能扩出东西来。
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活在当下
7楼2015-02-06 18:10:26
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dujincheng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这种情况可能原因有三：一是引物设计有问题。二是镁离子浓度过高、退火温度过低、pcr循环次数过多。三就是酶的问题。根据你的实验，问问别人是否也遇到同样的问题，判断一下可能是哪个环节出现问题啦！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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万物看似随机，但都有其定律。
10楼2015-02-09 10:18:00
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普通回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-02-06 09:59:15
引物设计有问题吧，应该是非特异性扩增。不同的温度下亮度也不一样，并且都是在100bp左右，说明目的条带没有你那个100bp好扩
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3楼2015-02-06 09:54:45
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iuipig

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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4楼2015-02-06 12:20:45
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iuipig

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by rv1nm2y at 2015-02-06 09:54:45
引物设计有问题吧，应该是非特异性扩增。不同的温度下亮度也不一样，并且都是在100bp左右，说明目的条带没有你那个100bp好扩

我是用3组引物扩增不同的目的前段的，但是都在100bp偏下出现条带，不应该是其他基因的扩增。

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5楼2015-02-06 12:23:16
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶的特异性不强吧，换个酶试试。
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永远相信未知的总是美好的！
6楼2015-02-06 17:19:55
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iuipig

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-02-06 17:19:55
酶的特异性不强吧，换个酶试试。

酶的特异性？我用的是taq酶mix，实验室都用这个

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2015-02-07 11:34:53
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iuipig

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by iuipig at 2015-02-07 11:34:53
酶的特异性？我用的是taq酶mix，实验室都用这个
...

长知识了，降落pcr好东西，不过我摸了温度条件后准备做定量的，这样可以么？

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2015-02-07 11:39:07
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