24小时热门版块排行榜    

查看: 1037  |  回复: 10

iuipig

新虫 (初入文坛)

[求助] 温度梯度相关问题 已有4人参与

本人最近在摸索几对引物的最适退火温度,用来做相对定量pcr。
在摸索的过程中出现这样的情况:目的条带大约200bp左右,都是没有出现,过着出现很淡,而在100bp附近(以下)出现条带,还会随着不同的温度亮度发生变化,很不解。设置的阴性对照(dd水为模板,引物和实验组一样),没有出现这样的条带。感觉又不能用引物二聚体解释。分别跑了1.5%和3%的胶,用D2000为marker。结果如下图。
这个是1.5%的胶 \"温度梯度相关问题\"
这个是3%的胶 \"温度梯度相关问题-1\"
哪位大神请教了!!!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

怎么看不了图呢?
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-02-06 08:48:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxiqi

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我师哥说,要找到退火的最适温度就采用降落PCR,如果酶好的话,一般都能扩出东西来。
活在当下
7楼2015-02-06 18:10:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dujincheng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这种情况可能原因有三:一是引物设计有问题。二是镁离子浓度过高、退火温度过低、pcr循环次数过多。三就是酶的问题。根据你的实验,问问别人是否也遇到同样的问题,判断一下可能是哪个环节出现问题啦!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
万物看似随机,但都有其定律。
10楼2015-02-09 10:18:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-02-06 09:59:15
引物设计有问题吧,应该是非特异性扩增。不同的温度下亮度也不一样,并且都是在100bp左右,说明目的条带没有你那个100bp好扩
3楼2015-02-06 09:54:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

iuipig

新虫 (初入文坛)

内容已删除
4楼2015-02-06 12:20:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

iuipig

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by rv1nm2y at 2015-02-06 09:54:45
引物设计有问题吧,应该是非特异性扩增。不同的温度下亮度也不一样,并且都是在100bp左右,说明目的条带没有你那个100bp好扩

我是用3组引物扩增不同的目的前段的,但是都在100bp偏下出现条带,不应该是其他基因的扩增。

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2015-02-06 12:23:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶的特异性不强吧,换个酶试试。
永远相信未知的总是美好的!
6楼2015-02-06 17:19:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

iuipig

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-02-06 17:19:55
酶的特异性不强吧,换个酶试试。

酶的特异性?我用的是taq酶mix,实验室都用这个

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2015-02-07 11:34:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

iuipig

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by iuipig at 2015-02-07 11:34:53
酶的特异性?我用的是taq酶mix,实验室都用这个
...

长知识了,降落pcr好东西,不过我摸了温度条件后准备做定量的,这样可以么?

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-02-07 11:39:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 iuipig 的主题更新
信息提示
请填处理意见