| 查看: 1999 | 回复: 1 | ||
[求助]
枯草芽孢杆菌感受态制备方法 已有1人参与
|
| 大家有没有枯草芽孢杆菌感受态的制备方法啊，急求，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有125人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 枯草芽孢杆菌培养后菌落形态是否会发生变化？
已经有9人回复
- 枯草芽孢杆菌芽孢萌发
已经有3人回复
- 枯草WB800电转
已经有4人回复
- 转化之后复苏感受态细胞能用加了氨苄的LB培养基吗？
已经有11人回复
- 枯草芽孢杆菌培养后离心问题
已经有5人回复
- NA培养基 枯草杆菌
已经有3人回复
- 急求！GFP载体转化野生型枯草芽孢杆菌以及红霉素浓度
已经有15人回复
- 关于枯草芽孢杆菌计数以及生长曲线的制作问题
已经有23人回复
- 枯草芽孢杆菌生长曲线
已经有6人回复
- 革兰氏阳性菌感受态的制备及转化
已经有14人回复
- 枯草杆菌 电转化
已经有13人回复
- 做枯草芽孢杆菌感受态用什么方法好？要详细步骤，谢谢
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒转化枯草杆菌感受态原理
已经有4人回复
- 【求助/交流】如何使枯草芽孢杆菌产芽孢
已经有10人回复
- 【求助/交流】pET-28a在大肠杆菌K-12中拷贝数
已经有11人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
574759350(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-03-10 22:39:06
574759350(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-03-10 22:39:06
|
一、感受态制备 新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于3ml LB液体培养基中，过夜培养12h； 2）取过夜培养物接入50ml LB+0.5M 山梨醇，37℃，200rpm培养至对数生长期OD600=0.85~0.95（控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD≈0.2，大约3-4h）；枯草芽孢杆菌T0期（对数生长期末期到稳定期）形成感受态， 3）取全部菌液冰浴10 min，然后5000rpm，6min，4℃离心收集菌体； 4）用30ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油）重新吹悬菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗4次； 5）将洗涤后的菌体吹悬于0.5 ml电转培养基中，分装60μl/ 管,直接电转化，或者于-80℃保藏。 制备感受态细胞注事项： 1. 每次制备感受态细胞的致敏缓冲液都应该新鲜配制； 2.感受太细胞在－80℃储存5－6周后，其转化率会降低，可以用已知标准闭环质粒来鉴定感受态细胞的转化能力； 3.制备感受态用的器皿（三角瓶，离心杯，电转化杯）都要洗刷干净，不要有任何去污剂和离子的残留； 4.整个过程要低温； 5.摇菌的OD值不要超过1； 6.在10% 甘油+0.5山梨醇+0.5甘露醇的基础上再加入0.5M海藻糖，可提高转化率。 7.平板抗性可适度降低； 8.复苏时提高溶氧将低转速。 二、电转化 1）将60μl感受态细胞中加入50ng质粒DNA（1~8μl），冰上孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。 (感受态细胞从-80冰箱拿出来后在冰上融化，DNA样品加入感受态也要在冰上完成，并且混合后立刻擦干电转) 电转仪设置：2.0kv（25μF 200Ω 1mm ）电击1次（时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率） 2）电击完毕取出杯子并立即加入（在酒精灯旁即可）1ml RM动作要轻柔（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，120rpm，复苏3h; 3）5000 rpm离心,5分钟,弃上清剩100ul， 涂板 37℃，过夜培养。 |
2楼2015-03-10 21:56:13
