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枯草WB800电转 已有1人参与
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| 请教各位，看了不少电转方案，奇怪的是洗涤/电转液有的用的是0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10%甘油，有的却是把10%甘油换成了10%葡萄糖，请问这个和10%甘油哪个更好呢？文献里看的都是加甘油。拜谢！ |
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yipan 
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-03-17 10:25:12
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-03-17 10:25:12
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枯草芽孢杆菌电转方案（高渗透法） 转化 1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。 2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95. 3）将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃离心收集菌体。 4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。 5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120。 6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率） 7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。 准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。 |
2楼2014-03-17 09:46:21
3楼2014-03-17 15:10:35
yipan
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【答案】应助回帖
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xissy: 金币+2, 和我所需要的相差甚远，但还是谢谢吧~ 2014-03-17 16:42:05
xissy: 金币+2, 和我所需要的相差甚远，但还是谢谢吧~ 2014-03-17 16:42:05
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其实是根据实验方法的不同，用的试剂 培养基不同。没有什么优劣。 第一种方法：电转化 实验试剂： GM:LB+0.5M 山梨醇 ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油 RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇 电转仪：eppendorf 第二种方法：Spizizen转化 Spizizen基本培养基：10×Spizzen基本盐培养基100ml/L，50%(w/v)葡萄糖10ml/L，色氨酸母液（5mg/ml）10ml/L，琼脂1.5%（w/v）。0.06Mpa压力下灭菌20min。 第三种方法：原生质体法(Takashi) CM培养基 葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物2％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，pH7.2，115℃灭菌15min 2*SMM培养基 蔗糖342.4g（1M），顺丁烯二酸4.46g（0.04M），MgCl2•6H2O 8.12g（0.04M）加去离子水定容至1000mL，pH7.5，115℃灭菌15min HCP-1.5培养基 250ml琥珀酸钠（2M PH7.3），酪蛋白水解物5g，酵母抽提物5g, MgCl2•6H2O 1.9g,葡萄糖 5g， K2HPO4 3.5g , KH2PO4 1.5g, 聚乙烯吡咯烷酮15g ,115℃灭菌15min 再生培养基：HCP-1.5培养基加2%琼脂 半固体HCP-1.5培养基：HCP-1.5培养基加0.8%琼脂 溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 第四种方法：原生质体转化之二 2*SMM培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M）加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min SMMP培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%加去离子水定容至1000mL，pH7.0，115℃灭菌15min CMR完全再生培养基： 蔗糖172.2g（0.5M），顺丁烯二酸2.23g（0.02M），MgCl2•6H2O 4.06g（0.02M），葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母抽提物1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.5%，调pH7.2～7.5，而后加入1.5％的琼脂粉，115℃灭菌15min. 溶菌酶（一般用途）用水配制成50mg/mL溶菌酶溶液，分装成小份，保存于-20℃。 溶菌酶(原生质体转化)普通溶菌酶0.22μm过滤灭菌后，用SMMP调制成1mg/mL的终浓度。 |
4楼2014-03-17 15:25:18
5楼2015-01-30 17:23:04
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