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574759350

铁虫 (小有名气)

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[求助] 枯草芽孢杆菌感受态制备方法已有1人参与

大家有没有枯草芽孢杆菌感受态的制备方法啊，急求，谢谢！

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1楼 2015-01-19 14:25:51

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lyl4840361

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
574759350(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2015-03-10 22:39:06

一、感受态制备
新鲜平板挑单菌落（小一点为好）接种于3ml LB液体培养基中，过夜培养12h；
2）取过夜培养物接入50ml LB+0.5M 山梨醇，37℃，200rpm培养至对数生长期OD600=0.85~0.95（控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD≈0.2，大约3-4h）；枯草芽孢杆菌T0期（对数生长期末期到稳定期）形成感受态，
3）取全部菌液冰浴10 min，然后5000rpm，6min，4℃离心收集菌体；
4）用30ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油）重新吹悬菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗4次；
5）将洗涤后的菌体吹悬于0.5 ml电转培养基中，分装60μl/ 管,直接电转化，或者于-80℃保藏。
制备感受态细胞注事项：
1. 每次制备感受态细胞的致敏缓冲液都应该新鲜配制；
2.感受太细胞在－80℃储存5－6周后，其转化率会降低，可以用已知标准闭环质粒来鉴定感受态细胞的转化能力；
3.制备感受态用的器皿（三角瓶，离心杯，电转化杯）都要洗刷干净，不要有任何去污剂和离子的残留；
4.整个过程要低温；
5.摇菌的OD值不要超过1；
6.在10% 甘油+0.5山梨醇+0.5甘露醇的基础上再加入0.5M海藻糖，可提高转化率。
7.平板抗性可适度降低；
8.复苏时提高溶氧将低转速。
二、电转化
1）将60μl感受态细胞中加入50ng质粒DNA（1~8μl），冰上孵育5min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。
(感受态细胞从-80冰箱拿出来后在冰上融化，DNA样品加入感受态也要在冰上完成，并且混合后立刻擦干电转)
电转仪设置：2.0kv（25μF 200Ω 1mm ）电击1次（时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率）
2）电击完毕取出杯子并立即加入（在酒精灯旁即可）1ml RM动作要轻柔（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，120rpm，复苏3h;
3）5000 rpm离心,5分钟,弃上清剩100ul，涂板 37℃，过夜培养。

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