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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 微米和纳米 » 性能应用 » 关于羧基聚苯乙烯微球偶联抗体后的稳定性问题
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王雨云

金虫 (小有名气)

[求助] 关于羧基聚苯乙烯微球偶联抗体后的稳定性问题 已有1人参与

0.2um的羧基聚苯乙烯微球，通过EDC活化后偶联一个抗体，微球抗体复合物4度保存稳定性差。主要是4度保存后荧光信号会明显高于刚稀释好的微球的荧光信号，分析原因是聚苯乙烯微球的疏水作用，静电作用等可能导致微球包被抗体后发生部分凝集（肉眼不可见的凝集），通过优化标记抗体的浓度，缓冲液pH，EDC用量等均未能改变微球抗体复合物4度保存荧光信号升高的问题，望各位虫友给点好建议啊！如何稳定保存！
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1楼 2015-01-08 13:53:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

youjihuaxue2000

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
王雨云: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2015-02-02 12:59:55
200nm荧光，你是做免疫层析吗？造成不稳定的原因复杂，但都能归结为微球表面电荷被平衡掉了。两微球靠彼此之间的电荷斥力分开，使整个体系维持溶胶状态。从EDC的加入开始，这种电荷平衡就被打破，后面加入抗体、封闭剂的时候，如果不能回复电荷平衡，体系就是不稳定的。所以，不妨试试：（1）选择表面电荷更多的微球，EDC只活化部分羧基，剩下部分来提供负电荷；（2）选择带同种电荷的blocker。（3）还得找个有经验的人手把手教你，细节很重要，呵呵。
欢迎交流huxuhua2008@163.com

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2楼2015-02-02 08:00:03
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by youjihuaxue2000 at 2015-02-03 07:44:46
pH太高。你可查一下EDC和NHS的水解pH，你把pH调这么高，我怀疑几乎没有共价交联。5.4是最佳的，但不适合。一般用6~6.5。

pH越高标记后的微球抗体复合物活性越低，6左右确实标记出来的微球抗体复合物活性很高，但仍改变不了2-8度保存荧光信号增强的问题。羧基微球理论上在没有EDC存在的情况下也应该可以跟带氨基的抗体反应才对，至于稳定不稳定就很难说了。目前我的实验是通过EDC活化后化学交联抗体的，2-8度保存稳定性还是有问题。2-8度保存后的变化规律一般是先明显升高后总体保持不变，37度热破坏5天内还不容易出现信号减弱的情况。有的人就是通过标记完成后先热破坏再来验证稳定性的。
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5楼2015-02-03 08:49:07
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deyunliu

禁虫 (知名作家)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-03-02 22:02:00
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普通回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youjihuaxue2000 at 2015-02-02 08:00:03
200nm荧光，你是做免疫层析吗？造成不稳定的原因复杂，但都能归结为微球表面电荷被平衡掉了。两微球靠彼此之间的电荷斥力分开，使整个体系维持溶胶状态。从EDC的加入开始，这种电荷平衡就被打破，后面加入抗体、封闭 ...

是做免疫层析的，标记pH做过6.0-9.0，用BSA作为封闭蛋白，理论上已经算选择的带同种电荷的blocker了吧。但还是没有改善2-8度保存荧光信号增强的问题。
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3楼2015-02-02 13:21:12
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youjihuaxue2000

银虫 (小有名气)
pH太高。你可查一下EDC和NHS的水解pH，你把pH调这么高，我怀疑几乎没有共价交联。5.4是最佳的，但不适合。一般用6~6.5。

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4楼2015-02-03 07:44:46
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youjihuaxue2000

银虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
您提到：（1）荧光信号增强。很可能荧光物质泄漏出来，直接和蛋白质相互作用了，可能两者存在能量共振转移，这会使荧光增强。你不妨问问厂家，微球里面的荧光染料是不是疏水的？并仔细观察：（a）体系是否用了极性较强的有机物？（b）试剂瓶壁或表面是否有一层油一样的东西？（2）羧基微球理论上在没有EDC存在的情况下也应该可以跟带氨基的抗体反应。是的，通过离子键相互作用，但很弱。实际上，即使有EDC活化的情况下，微球首先通过被动吸附和蛋白相互作用，然后才发生共价交联。这些非共价的结合，是后来不稳定的根源之一。你不妨在封闭后加一步3~5min的超声，那些不稳定的结合，自然会脱离下来。

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6楼2015-03-01 01:42:06
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王雨云

金虫 (小有名气)
1  微球里包埋的是稀土铕，可能是通过溶胀方式包埋的吧，漏出来的可能性应该不是很大。
2  体系中应该没有什么较强的极性有机物。试剂瓶表面未出现油一样的漂浮物，微球本身肉眼可见还是澄清透亮的，感觉单分散性还可以。
3  封闭之后一直有超声的步骤，一般都要超声5min左右。还试过标记完抗体后先离心去除游离的抗体，再加蛋白封闭，结果差别不大。
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7楼2015-03-02 17:10:55
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youjihuaxue2000

银虫 (小有名气)
非荧光染料染色的彩球，是我们的常规产品，目前应用广泛，比如流体力学。在诊断上，主要是彩色层析和免疫凝集反应。

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9楼2015-09-17 17:20:02
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liu198922

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youjihuaxue2000 at 2015-02-02 08:00:03
200nm荧光，你是做免疫层析吗？造成不稳定的原因复杂，但都能归结为微球表面电荷被平衡掉了。两微球靠彼此之间的电荷斥力分开，使整个体系维持溶胶状态。从EDC的加入开始，这种电荷平衡就被打破，后面加入抗体、封闭 ...

请问楼主解决这个问题了吗？我最近也遇到这样的问题，请问楼主是怎么解决的呢？
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10楼2016-07-06 10:17:52
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