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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因克隆中，每次做到阳筛时就做不出来，求解?
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路尽繁华

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因克隆中，每次做到阳筛时就做不出来，求解? 已有5人参与

将目的基因、双酶切载体，重组转入感受态，经培养长出几个菌落，然后进行阳筛，采取相应的pcr体系，总是跑不出结果，得到的只有引物二聚体，求各位大神指教啊！
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1楼 2014-12-29 21:42:56
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mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-30 12:07:24
路尽繁华: 金币+2, ★有帮助 2014-12-30 17:22:07
双酶切一般来说还是比较容易成功的，片段和载体酶切后最好采用胶回收，根据二者的大小选择合适的比例进行连接，如果这样还不行的话就换个连接酶试试看。
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2楼2014-12-30 09:39:04
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路尽繁华

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mumu624 at 2014-12-30 09:39:04
双酶切一般来说还是比较容易成功的，片段和载体酶切后最好采用胶回收，根据二者的大小选择合适的比例进行连接，如果这样还不行的话就换个连接酶试试看。

那平板长出的菌落，是没连接成功么？麻烦分析一下下啊
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3楼2014-12-30 13:35:00
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
路尽繁华: 金币+1 2014-12-30 17:22:18
长的菌落太少了，你重新做一下。
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4楼2014-12-30 13:39:48
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昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
路尽繁华: 金币+2, ★有帮助 2014-12-30 17:22:28
首先要保证目的片段和载体的浓度都不能太低，其次目的片段的长度也会影响链接效率，最后还要保证感受态细胞的活力
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太阳出来，星星要走。
5楼2014-12-30 15:11:12
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mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 路尽繁华 at 2014-12-30 13:35:00
那平板长出的菌落，是没连接成功么？麻烦分析一下下啊...

你不是经过鉴定是假阳性莫？酶切连接得到的转化子一般来说不会很多。另外，快速筛选阳性克隆的方法有很多，比如菌落PCR或者质粒抽等等。建议你在确定片段和酶切载体质量的前提下，优化下连接体系，然后转化筛选。
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6楼2014-12-30 15:31:06
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路尽繁华

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 昺昺 at 2014-12-30 15:11:12
首先要保证目的片段和载体的浓度都不能太低，其次目的片段的长度也会影响链接效率，最后还要保证感受态细胞的活力

感受态买的活力应该可以，载体与目的片段比例=1:3，目的片段近2kb
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7楼2014-12-30 17:17:45
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路尽繁华

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-12-30 13:39:48
长的菌落太少了，你重新做一下。

应该不是菌的多少缘故吧，长多了怕杂菌，长少了只要重组成功就欢喜了，就是阳筛不出结果
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8楼2014-12-30 17:20:05
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路尽繁华

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mumu624 at 2014-12-30 15:31:06
你不是经过鉴定是假阳性莫？酶切连接得到的转化子一般来说不会很多。另外，快速筛选阳性克隆的方法有很多，比如菌落PCR或者质粒抽等等。建议你在确定片段和酶切载体质量的前提下，优化下连接体系，然后转化筛选。...

连接体系对转化到底有多大影响啊
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9楼2014-12-30 17:25:29
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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同意6楼的说法，有可能是假阳性，楼主应该初筛后做复筛，然后再向下进行
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10楼2014-12-30 18:44:53
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