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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 包涵体蛋白的柱上复性方法 已有2人参与

有没有大侠做过包涵体蛋白的复性的?都用的什么方法。最近一直在做包涵体蛋白的复性,选择了透析复性,结果复性后除了蛋白浓度降低以外,活性几乎没有任何的改变?听说柱上复性复性率高,查了很多资料但是具体不知道怎么做,还请大侠们指点一下。做了一个多月了始终没有进展,万分火急,请大家多多帮忙,谢谢
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张冰宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xissy at 2015-01-14 15:09:48
1.你说的活性指的是测蛋白的酶活吗?如果最后透析到不含尿素或者盐酸胍的buffer里,没有酶活的话,可能蛋白还是没有折叠正确。
2.柱上复性和透析复性很像。就是再柱上改变尿素的梯度,8M-6M-4M-3M-2M-1M-0.5M-0。最 ...

感谢您的帮助。我想问一下那复性的柱子是什么柱子啊?是蛋白纯化的柱子吗。因为我没用过,不大清楚。还有就是在柱上换尿素的浓度是不需要离心什么的对吗?
3楼2015-01-15 10:40:42
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xissy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1.你说的活性指的是测蛋白的酶活吗?如果最后透析到不含尿素或者盐酸胍的buffer里,没有酶活的话,可能蛋白还是没有折叠正确。
2.柱上复性和透析复性很像。就是再柱上改变尿素的梯度,8M-6M-4M-3M-2M-1M-0.5M-0。最后能成功洗下来的蛋白就是复性成功的蛋白。
2楼2015-01-14 15:09:48
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xissy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 张冰宝 at 2015-01-15 10:40:42
感谢您的帮助。我想问一下那复性的柱子是什么柱子啊?是蛋白纯化的柱子吗。因为我没用过,不大清楚。还有就是在柱上换尿素的浓度是不需要离心什么的对吗?...

就是纯化的柱子。柱上换尿素离心?不懂你的意思。例如倒几个柱体积的8M尿素-再几个柱体积的6M尿素,依次下降。但是这个速度要控制好,不能太快了,不然复性速度太快成功率也会下降的。所以如果有纯化仪的话,用机器控制是最好了的。
4楼2015-01-15 10:49:03
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张冰宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by xissy at 2015-01-15 10:49:03
就是纯化的柱子。柱上换尿素离心?不懂你的意思。例如倒几个柱体积的8M尿素-再几个柱体积的6M尿素,依次下降。但是这个速度要控制好,不能太快了,不然复性速度太快成功率也会下降的。所以如果有纯化仪的话,用机器 ...

o 我明白了这个就是说我把我纯化的蛋白加入柱子里,然后依次的加不同浓度的尿素溶液。有几个问题想在请教一下
1.加入不同浓度的尿素溶液是直接倒入柱子里吗?还是说是少量多次的加?
2.滤掉的尿素溶液是否直接倒掉?然后开始换下一浓度的尿素溶液?
3.最后的我的蛋白是怎么收集的呢?收集的时候需要注意什么?
4.复性对于蛋白的浓度有没有要求?
非常感谢你的帮助,因为没什么经验所以要问的详细一些。如果您有复性的具体步骤什么的就更好了。非常感谢
5楼2015-01-15 13:46:53
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