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sherry_cjy

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sherry_cjy

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2楼2014-12-10 19:52:07
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sherry_cjy(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-11 21:09:39
pcr产物是不是可以切胶回收纯化一下?如果测序信号还不好的话,是否可以尝试连载体后测序?

BSA应该可以增加PCR特异性和扩增效率吧,纯化后的pcr产物中已经不含BSA了,对后续应该没影响。
做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-12-11 08:34:57
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sherry_cjy

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4楼2014-12-11 15:34:59
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june0609

捐助贵宾 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by sherry_cjy at 2014-12-11 15:34:59
谢谢~他们是过膜的方式纯化的,不过BSA应该也没有什么影响吧?之前用这个引物测序结果都是很好的,怎么这次就会这样呢?……连载体后测序又是好大的工作量,快毕不了业了……愁死我了...

BSA在经过纯化之后,应该会被去除,不影响测序。个人认为可能的问题有:
1.换测序公司再测一次,华大的一代测序不见得好,我们有在华大测过没信号的样品,送到其他公司去可以测出来的。你可以换几家都送送试试看。
2.确认一下测序引物是否合适。PCR的引物作为测序引物不一定合适。测序引物对匹配度的要求会更严格一些,不能有保护碱基等。另外,如果序列中存在引物结合的同源序列,或者高GC含量,也会影响测序。你可以把参考序列情况和测序公司说明一下,看他们是否能另外设计引物从片段中间开始测。
3.序列本身不纯。确认一下你的基因是否有多拷贝,是否有snp位点。之前我做过一个酵母的基因,因为是多倍体,序列中有一些位点存在多样性,最后测序结果在某个位点之后就很乱。最终还是通过TA克隆挑单克隆来解决的。做一次也挺快的,顺利的话3天左右就搞定了。

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5楼2014-12-12 23:05:00
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sherry_cjy

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6楼2014-12-17 13:41:43
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