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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR加了牛血清白蛋白之后，测序出现了问题
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sherry_cjy

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1楼 2014-12-10 19:49:55
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sherry_cjy

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2楼2014-12-10 19:52:07
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sherry_cjy(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-11 21:09:39
pcr产物是不是可以切胶回收纯化一下？如果测序信号还不好的话，是否可以尝试连载体后测序？

BSA应该可以增加PCR特异性和扩增效率吧，纯化后的pcr产物中已经不含BSA了，对后续应该没影响。
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-12-11 08:34:57
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sherry_cjy

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4楼2014-12-11 15:34:59
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june0609

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引用回帖:
4楼: Originally posted by sherry_cjy at 2014-12-11 15:34:59
谢谢~他们是过膜的方式纯化的，不过BSA应该也没有什么影响吧？之前用这个引物测序结果都是很好的，怎么这次就会这样呢？……连载体后测序又是好大的工作量，快毕不了业了……愁死我了...

BSA在经过纯化之后，应该会被去除，不影响测序。个人认为可能的问题有：
1.换测序公司再测一次，华大的一代测序不见得好，我们有在华大测过没信号的样品，送到其他公司去可以测出来的。你可以换几家都送送试试看。
2.确认一下测序引物是否合适。PCR的引物作为测序引物不一定合适。测序引物对匹配度的要求会更严格一些，不能有保护碱基等。另外，如果序列中存在引物结合的同源序列，或者高GC含量，也会影响测序。你可以把参考序列情况和测序公司说明一下，看他们是否能另外设计引物从片段中间开始测。
3.序列本身不纯。确认一下你的基因是否有多拷贝，是否有snp位点。之前我做过一个酵母的基因，因为是多倍体，序列中有一些位点存在多样性，最后测序结果在某个位点之后就很乱。最终还是通过TA克隆挑单克隆来解决的。做一次也挺快的，顺利的话3天左右就搞定了。
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sherry_cjy
5楼2014-12-12 23:05:00
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sherry_cjy

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6楼2014-12-17 13:41:43
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