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1楼2014-12-10 19:49:55

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

june0609

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引用回帖:

4楼: Originally posted by sherry_cjy at 2014-12-11 15:34:59
谢谢~他们是过膜的方式纯化的，不过BSA应该也没有什么影响吧？之前用这个引物测序结果都是很好的，怎么这次就会这样呢？……连载体后测序又是好大的工作量，快毕不了业了……愁死我了...

BSA在经过纯化之后，应该会被去除，不影响测序。个人认为可能的问题有：
1.换测序公司再测一次，华大的一代测序不见得好，我们有在华大测过没信号的样品，送到其他公司去可以测出来的。你可以换几家都送送试试看。
2.确认一下测序引物是否合适。PCR的引物作为测序引物不一定合适。测序引物对匹配度的要求会更严格一些，不能有保护碱基等。另外，如果序列中存在引物结合的同源序列，或者高GC含量，也会影响测序。你可以把参考序列情况和测序公司说明一下，看他们是否能另外设计引物从片段中间开始测。
3.序列本身不纯。确认一下你的基因是否有多拷贝，是否有snp位点。之前我做过一个酵母的基因，因为是多倍体，序列中有一些位点存在多样性，最后测序结果在某个位点之后就很乱。最终还是通过TA克隆挑单克隆来解决的。做一次也挺快的，顺利的话3天左右就搞定了。