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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)

[求助] 引物设计 已有3人参与

大家看一下我设计的引物合适不

引物设计
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1楼 2014-11-26 15:51:58
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-11-29 15:15:09
看了一下第一对引物，二聚体的概率不小--即使去除了酶切位点。把酶切位点加上之后，二聚体更多了。
上下游引物进行blast以后，与假丝酵母Candida utilis匹配度挺好，但是也与毕赤酵母Pichia jadinii strain CCTCC AY204007 uricase gene存在很高匹配。特异性有所影响，不过影响应该不大。
总体来说，应该能用。

一个小经验，设计引物时候可以多设计合成两套，到时候几套一起测试，哪套好用用哪套---毕竟现在引物和PCR反应液都很便宜了。
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贝努努哈哈
2楼2014-11-29 01:09:54
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peng~yu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个没有什么好不好的，现在我设计引物基本上都用眼看。建议楼主先去合成一下不加酶切位点的引物，能扩出来的话，直接把其他的东西写在引物的5'端就可以了。我们实验室在我的带领下都是这个设计的，特别的简单～楼主可以试试呢
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5楼2014-11-30 01:16:06
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lutu2013

新虫 (初入文坛)
用高保真酶扩，是没有问题!
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8楼2014-11-30 13:06:36
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
引用回帖:
2楼: Originally posted by soarrow at 2014-11-29 01:09:54
看了一下第一对引物，二聚体的概率不小--即使去除了酶切位点。把酶切位点加上之后，二聚体更多了。
上下游引物进行blast以后，与假丝酵母Candida utilis匹配度挺好，但是也与毕赤酵母Pichia jadinii strain CCTCC  ...

上个截图，第一对引物去掉酶切位点以后粗略看了一眼

引物设计-1
未标题-1 拷贝.gif
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贝努努哈哈
3楼2014-11-29 01:12:02
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-11-29 15:15:15
实际操作以后再说吧。很多时候用软件设计出来的不见得能扩增出来。我前段时间就遇到过这种情况，设计好了引物，各个条件都好，用软件模拟扩增也能扩出来，但实际中就是得不到目的条带。摸索了各种条件，再换了好几对引物都不行，直到最后换了酶才OK。所以楼主还是实际P一下再看吧。
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4楼2014-11-29 14:39:14
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peng~yu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外补充一点，由我做实验的经验来看，什么引物二聚体，自身互补啥的，基本上对反应结果没啥影响（只要不是多重就没事），主要就看两个引物退火温度差不多（3度之内吧）就好啦～楼主加油！！
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贝努努哈哈
6楼2014-11-30 01:17:51
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ccandcc

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by peng~yu at 2014-11-30 01:16:06
这个没有什么好不好的，现在我设计引物基本上都用眼看。建议楼主先去合成一下不加酶切位点的引物，能扩出来的话，直接把其他的东西写在引物的5'端就可以了。我们实验室在我的带领下都是这个设计的，特别的简单～楼主 ...

对头 我们试验室也是这个风气，简单高效，
实在不行多弄两个引物，效率最重要
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贝努努哈哈
7楼2014-11-30 11:06:26
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by peng~yu at 2014-11-30 01:17:51
另外补充一点，由我做实验的经验来看，什么引物二聚体，自身互补啥的，基本上对反应结果没啥影响（只要不是多重就没事），主要就看两个引物退火温度差不多（3度之内吧）就好啦～楼主加油！！

哇，知道了，以后可以请教你，
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下雨天就算没有伞，我也要学会努力奔跑！
9楼2014-11-30 18:38:50
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by soarrow at 2014-11-29 01:09:54
看了一下第一对引物，二聚体的概率不小--即使去除了酶切位点。把酶切位点加上之后，二聚体更多了。
上下游引物进行blast以后，与假丝酵母Candida utilis匹配度挺好，但是也与毕赤酵母Pichia jadinii strain CCTCC  ...

10楼2014-12-08 16:21:10
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