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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求赐教，扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好，还是用高保真再加A尾好一点？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 求赐教，扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好，还是用高保真再加A尾好一点？已有6人参与

实验室有全式金的FastPfu，扩增效率挺高的，倒是不存在一般的高保真酶扩增效率低的问题。不过这个真心贵，有点杀鸡焉用宰牛刀的感觉。我片段3000bp出头，想连T载体，用高保真的话要做完纯化加A尾，但是不知道加A尾后连接效率怎么样。
用高保真的Taq酶也行，但是看说明书也有说为了提高连接效率，可以纯化再加A尾，再连，这样和高保真一样繁琐了，还不如直接用高保真。如果这样再加一次A尾，连接效率会提高，倒也值得一试。
此外，加A尾对Taq酶有要求吗？用高保真的Taq酶和普通Taq酶是不是一样的呢？
希望高手能指点一二，万分感谢。
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1楼2014-09-29 21:28:23
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

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★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:18
用高保真的酶P，产物是平末端，然后就用普通的taq酶加A，72℃20分钟，就可以做TA克隆了！

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2楼2014-09-29 22:19:42
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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克隆出来最重要，普通酶也没问题的

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江山
3楼2014-09-30 03:45:56
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蓝索道人

木虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:36
用EX Taq酶，高保真+A ，一步纯化就可以连T载
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努力就有收获！
6楼2014-09-30 07:56:04
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
ggyy0911: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-01 10:05:16
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18楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 19:34:38
那能不能再问一个问题，你知道TA克隆和平末端克隆有什么优劣么？如果我不加A尾了，用平末端载体，比如pEASY，做模板连接目的片段，进行后续的PCR，会不会没有T载体效果好。...

说实话，我做了很多TA克隆，都是PCR加A，然后直接做连接，转化，效率蛮好的～～然后我也做了平末端链接，用的是thermo的pJET1.2/blunt Cloning Kit，做的也挺好的～你可以都试试～一般来说，buffer什么的，都不会有很大的影响，你做一个纯化，损失会很多，综合考虑，还不如直接连接～当然了，这也只是我个人的看法，你可以都试试，做一个对照看看嘛！

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19楼2014-10-01 07:41:55
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by mamadexiao at 2014-10-03 01:20:23
我用的是Takara的Gxl primerstar，效果很好，然后胶回收产物加A

能不能详细说一下啊，谢谢了
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27楼2014-10-03 20:06:21
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普通回帖

ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by langzian at 2014-09-30 03:45:56
克隆出来最重要，普通酶也没问题的

普通酶不能保真，我pcr鉴定之后，再p一次切胶回收担心它会突变。每p一次都有和之前序列不一样的担忧。

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4楼2014-09-30 07:40:48
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-29 22:19:42
用高保真的酶P，产物是平末端，然后就用普通的taq酶加A，72℃20分钟，就可以做TA克隆了！

请问这样效率怎么样？我实验过程挺繁琐的，加了A尾就多了一步纯化过程，确实影响实验进度。

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5楼2014-09-30 07:42:48
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蓝索道人 at 2014-09-30 07:56:04
用EX Taq酶，高保真+A ，一步纯化就可以连T载

似乎每种这样的酶，都会说再纯化一次加A尾可提高效率，不知道和高保真p后加尾相比如何，我是新手，有时候真的太纠结细枝末节了，非常纠结。

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7楼2014-09-30 08:09:32
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czfscf

金虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:45
我觉得则个还是主要看你要拿产物干嘛了，如果要求高，那就高保真，如果普通的，那就taq
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Ecological Genomics；the scientific walking hormone
8楼2014-09-30 08:55:01
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流氓一个

金虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:54
LA酶和EX Taq酶都比Taq酶效率高、保真性好，并且PCR后都自带A尾，可以和T载体直接连接，为什么还要纯化呢。。。
我的两千多的片段，效率很高。你的片段连接效率不高吗？
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我有我人生
9楼2014-09-30 09:06:54
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 流氓一个 at 2014-09-30 09:06:54
LA酶和EX Taq酶都比Taq酶效率高、保真性好，并且PCR后都自带A尾，可以和T载体直接连接，为什么还要纯化呢。。。
我的两千多的片段，效率很高。你的片段连接效率不高吗？

我的意思是如果用高保真，连了A尾之后还得再纯化一次。我还没连呢……这会没确定酶实验都做不下去了。
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10楼2014-09-30 09:36:20
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