【答案】应助回帖

11楼2014-09-30 09:37:56

流氓一个

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10楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 09:36:20
我的意思是如果用高保真，连了A尾之后还得再纯化一次。我还没连呢……

这会没确定酶实验都做不下去了。...

PCR后都要纯化的。高保真酶P的是平末端，再连A尾又多了一道工序；实验室有LA酶和EX Taq酶的话，就不用连A尾了。

我有我人生

12楼2014-09-30 09:54:50

jian212

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ggyy0911: 金币+2, ★有帮助 2014-09-30 12:07:25
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:52:09

加A尾对Taq酶有要求吗？用高保真的Taq酶和普通Taq酶是不是一样的呢？

PCR产物扩增完纯化之后加A尾对taq 酶没什么要求的。
两种都可以用。
就连接效率确实没有直接用TAQ 的高。建议多延伸点时间。

学习再学习，努力再努力。

13楼2014-09-30 11:07:20

czfscf

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11楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 09:37:56
连克隆载体扩增。然后要把目的基因再连接到表达载体，表达。...

那要高保真了

Ecological Genomics；the scientific walking hormone

14楼2014-09-30 11:44:27

ncuduhan

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5楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 07:42:48
请问这样效率怎么样？我实验过程挺繁琐的，加了A尾就多了一步纯化过程，确实影响实验进度。
...

加A后直接做链接啊！不用再纯化了

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15楼2014-09-30 12:08:21

ggyy0911

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15楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-30 12:08:21
加A后直接做链接啊！不用再纯化了
...

那还有一堆缓冲液和酶呢，不影响连接吗

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16楼2014-09-30 14:18:55

jian212

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16楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 14:18:55
那还有一堆缓冲液和酶呢，不影响连接吗
...

肯定要影响的，为了确保连接的效率建议还是纯化。

学习再学习，努力再努力。

17楼2014-09-30 15:29:07

ggyy0911

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17楼: Originally posted by jian212 at 2014-09-30 15:29:07
肯定要影响的，为了确保连接的效率建议还是纯化。...

那能不能再问一个问题，你知道TA克隆和平末端克隆有什么优劣么？如果我不加A尾了，用平末端载体，比如pEASY，做模板连接目的片段，进行后续的PCR，会不会没有T载体效果好。

18楼2014-09-30 19:34:38

ncuduhan

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ggyy0911: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-01 10:05:16

引用回帖:

18楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 19:34:38
那能不能再问一个问题，你知道TA克隆和平末端克隆有什么优劣么？如果我不加A尾了，用平末端载体，比如pEASY，做模板连接目的片段，进行后续的PCR，会不会没有T载体效果好。...

说实话，我做了很多TA克隆，都是PCR加A，然后直接做连接，转化，效率蛮好的～～然后我也做了平末端链接，用的是thermo的pJET1.2/blunt Cloning Kit，做的也挺好的～你可以都试试～一般来说，buffer什么的，都不会有很大的影响，你做一个纯化，损失会很多，综合考虑，还不如直接连接～当然了，这也只是我个人的看法，你可以都试试，做一个对照看看嘛！

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19楼2014-10-01 07:41:55

ggyy0911

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19楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-10-01 07:41:55
说实话，我做了很多TA克隆，都是PCR加A，然后直接做连接，转化，效率蛮好的～～然后我也做了平末端链接，用的是thermo的pJET1.2/blunt Cloning Kit，做的也挺好的～你可以都试试～一般来说，buffer什么的，都不会有 ...

非常感谢～你的经验对我来说太有用了～今天多做了一批PCR，大概是够用做个对照的～

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20楼2014-10-01 10:05:04