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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求赐教，扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好，还是用高保真再加A尾好一点？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 求赐教，扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好，还是用高保真再加A尾好一点？ 已有6人参与

实验室有全式金的FastPfu，扩增效率挺高的，倒是不存在一般的高保真酶扩增效率低的问题。不过这个真心贵，有点杀鸡焉用宰牛刀的感觉。我片段3000bp出头，想连T载体，用高保真的话要做完纯化加A尾，但是不知道加A尾后连接效率怎么样。
用高保真的Taq酶也行，但是看说明书也有说为了提高连接效率，可以纯化再加A尾，再连，这样和高保真一样繁琐了，还不如直接用高保真。如果这样再加一次A尾，连接效率会提高，倒也值得一试。
此外，加A尾对Taq酶有要求吗？用高保真的Taq酶和普通Taq酶是不是一样的呢？
希望高手能指点一二，万分感谢。
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1楼 2014-09-29 21:28:23
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
ggyy0911: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-01 10:05:16
引用回帖:
18楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-09-30 19:34:38
那能不能再问一个问题，你知道TA克隆和平末端克隆有什么优劣么？如果我不加A尾了，用平末端载体，比如pEASY，做模板连接目的片段，进行后续的PCR，会不会没有T载体效果好。...

说实话，我做了很多TA克隆，都是PCR加A，然后直接做连接，转化，效率蛮好的～～然后我也做了平末端链接，用的是thermo的pJET1.2/blunt Cloning Kit，做的也挺好的～你可以都试试～一般来说，buffer什么的，都不会有很大的影响，你做一个纯化，损失会很多，综合考虑，还不如直接连接～当然了，这也只是我个人的看法，你可以都试试，做一个对照看看嘛！

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19楼2014-10-01 07:41:55
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:18
用高保真的酶P，产物是平末端，然后就用普通的taq酶加A，72℃20分钟，就可以做TA克隆了！

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2楼2014-09-29 22:19:42
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:26
克隆出来最重要，普通酶也没问题的

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江山
3楼2014-09-30 03:45:56
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by langzian at 2014-09-30 03:45:56
克隆出来最重要，普通酶也没问题的

普通酶不能保真，我pcr鉴定之后，再p一次切胶回收担心它会突变。每p一次都有和之前序列不一样的担忧。

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4楼2014-09-30 07:40:48
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