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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 求赐教,扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好,还是用高保真再加A尾好一点? 已有6人参与

实验室有全式金的FastPfu,扩增效率挺高的,倒是不存在一般的高保真酶扩增效率低的问题。不过这个真心贵,有点杀鸡焉用宰牛刀的感觉。我片段3000bp出头,想连T载体,用高保真的话要做完纯化加A尾,但是不知道加A尾后连接效率怎么样。
用高保真的Taq酶也行,但是看说明书也有说为了提高连接效率,可以纯化再加A尾,再连,这样和高保真一样繁琐了,还不如直接用高保真。如果这样再加一次A尾,连接效率会提高,倒也值得一试。
此外,加A尾对Taq酶有要求吗?用高保真的Taq酶和普通Taq酶是不是一样的呢?
希望高手能指点一二,万分感谢。
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by langzian at 2014-09-30 03:45:56
克隆出来最重要,普通酶也没问题的

普通酶不能保真,我pcr鉴定之后,再p一次切胶回收担心它会突变。每p一次都有和之前序列不一样的担忧。

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4楼2014-09-30 07:40:48
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:18
用高保真的酶P,产物是平末端,然后就用普通的taq酶加A,72℃20分钟,就可以做TA克隆了!

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-09-29 22:19:42
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-30 14:51:26
克隆出来最重要,普通酶也没问题的

[ 发自小木虫客户端 ]
江山
3楼2014-09-30 03:45:56
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-29 22:19:42
用高保真的酶P,产物是平末端,然后就用普通的taq酶加A,72℃20分钟,就可以做TA克隆了!

请问这样效率怎么样?我实验过程挺繁琐的,加了A尾就多了一步纯化过程,确实影响实验进度。

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-09-30 07:42:48
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