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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化 已有8人参与

用镍柱进行蛋白纯化时，首先要获得菌体后裂解细胞，我选择的是超声破碎，我的蛋白是包涵体，但是我每次超声完后原来浑浊的菌体溶液都会变得清亮透明，离心以后几乎没有沉淀，不知道是怎么回事？难道是我超声的力度太大了，把包涵体都超声没啦？新手 请多帮忙
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1楼 2014-09-25 13:55:28
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putao57819

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-25 20:59:38
不确定问题在哪里。建议增加培养的菌量，降低超声强度，取超声前，超声后的菌液，离心上清和离心沉淀跑电泳来确定问题在哪里。
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2楼2014-09-25 16:40:02
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非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-27 10:46:50
是不是超声功率太大 时间太长 即便蛋白是包涵体  菌体碎片 肯定会有离心下来的  再者是你转速太低 一般要13000rpm 30min 4℃离心 我们实验室做的话
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3楼2014-09-25 21:01:23
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用什么样裂解液?
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4楼2014-09-26 08:45:19
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 非常6+1 at 2014-09-25 21:01:23
是不是超声功率太大 时间太长 即便蛋白是包涵体  菌体碎片 肯定会有离心下来的  再者是你转速太低 一般要13000rpm 30min 4℃离心 我们实验室做的话

我离心用的是16000g 4度 20min 。感觉这么强是可以离会下来的。超声的强度大会把细菌裂解，也会把包涵体裂碎吗？为什么超声完都是澄清的液体呢？
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5楼2014-09-26 08:50:15
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by putao57819 at 2014-09-25 16:40:02
不确定问题在哪里。建议增加培养的菌量，降低超声强度，取超声前，超声后的菌液，离心上清和离心沉淀跑电泳来确定问题在哪里。

我收集的是200ml的菌液，离心后菌液沉淀很多。超声后就没有沉淀了。
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6楼2014-09-26 08:51:40
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by winterb at 2014-09-26 08:45:19
你用什么样裂解液?

我是用的buffee B ，就是用相应的尿素，tris-cl  base和磷酸二氢钠配置的、
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7楼2014-09-26 08:53:39
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

问题在你用的是尿素.不使用尿素,你可以试试.
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8楼2014-09-26 09:07:08
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by winterb at 2014-09-26 09:07:08
问题在你用的是尿素.不使用尿素,你可以试试.

我用的是默克密理博的柱子和说明书，那上面纯化的时候所用的溶液就是用尿素配的啊
你指的不用尿素，是我配置时不用尿素，还是换其他的缓冲液呢？
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9楼2014-09-26 09:20:14
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-29 19:46:38
尿素溶解了包涵体 所以超声后就没有沉淀了.你可以用 50mM tris buffer 溶解细胞沉淀,再超声破碎.
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10楼2014-09-26 10:17:51
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