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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by myheat at 2014-09-28 20:26:33
那说明表达在上清非包涵体。如果裂解液不含极端变性剂。

我做小量诱导，超声后跑胶，上清和沉淀。上清几乎没有条带，而沉淀条带却非常非常组，因此断定是包涵体。
我使用的裂解液就是用尿素 tris-base 和磷酸氢二钠配置的。你说的极端变性剂指的都是哪些呢？
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21楼2014-09-29 08:53:53
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by winterb at 2014-09-28 19:50:47
你应该改变破碎方式使用高压破碎. 超声破碎只是用在少量菌液.

其他的破碎方式我们实验室没有应用过，师姐做的时候都是超声破碎的。不知道你说的高压破碎要怎么操作呢？
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22楼2014-09-29 08:55:23
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by laojiu9878 at 2014-09-28 14:56:50
增大离心力，转速看看情况

超声后溶液比较澄清，我用的转速已经很大了，
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23楼2014-09-29 08:56:05
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是因为你加的尿素把包涵体溶解了，所以看不到沉淀。你可以这样，先把菌体用Tris-HCL缓冲液（pH8.0,不含尿素)悬浮，超声破碎后离心，去上清，沉淀用含8M 尿素的 20mM Tris-HCL,0.5M Nacl，pH8.0的缓冲液（为提高重组蛋白纯度，可在此缓冲液中加入10-40mM 咪唑）溶解。过滤后上镍柱纯化。
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24楼2014-09-29 09:11:40
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-09-29 09:11:40
是因为你加的尿素把包涵体溶解了，所以看不到沉淀。你可以这样，先把菌体用Tris-HCL缓冲液（pH8.0,不含尿素)悬浮，超声破碎后离心，去上清，沉淀用含8M 尿素的 20mM Tris-HCL,0.5M Nacl，pH8.0的缓冲液（为提高重组 ...

非常感谢。
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25楼2014-09-29 09:49:33
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

French Press (SLM Instruments,  Urbana,IL)
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26楼2014-09-29 10:06:11
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by winterb at 2014-09-29 10:06:11
French Press (SLM Instruments,  Urbana,IL)

实验室不具备这样的仪器，但是还是很感谢哦
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27楼2014-09-29 10:11:30
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
21楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-09-29 08:53:53
我做小量诱导，超声后跑胶，上清和沉淀。上清几乎没有条带，而沉淀条带却非常非常组，因此断定是包涵体。
我使用的裂解液就是用尿素 tris-base 和磷酸氢二钠配置的。你说的极端变性剂指的都是哪些呢？...

4-8M尿素，盐酸胍，sds等强变性剂。不知道你小量诱导条件与放大后表达条件是否一致?

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28楼2014-09-29 12:06:26
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by myheat at 2014-09-29 12:06:26
4-8M尿素，盐酸胍，sds等强变性剂。不知道你小量诱导条件与放大后表达条件是否一致?
...

条件是一致的。
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29楼2014-09-29 14:04:47
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
29楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-09-29 14:04:47
条件是一致的。...

裂解液不加尿素，若破胞还是很清亮，要么上清表达可直接过ni柱富集，要么没有表达，或者表达低。

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30楼2014-09-29 18:13:38
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