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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by winterb at 2014-09-26 10:17:51
尿素溶解了包涵体 所以超声后就没有沉淀了.你可以用 50mM tris buffer 溶解细胞沉淀,再超声破碎.

哦 原来是这样啊。我超声的时间是15分钟，超声十秒间隔十秒。这样时间算长吗？ 还有就是我洗脱的时候用的也是尿素配置的缓冲液。洗脱的条带不是很粗，还有杂带？怎么回事呢
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11楼2014-09-26 10:43:16
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-27 10:47:08
通常超声的时间是45秒，超声15秒间隔15秒.  洗脱是用尿素 +咪唑梯度洗脱.
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12楼2014-09-27 09:18:21
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yangyufeng88

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是buffer中有尿素导致包涵体溶解，可做WB验证目标蛋白是否表达
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要适应生活，才能改变生活！
13楼2014-09-27 18:16:29
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chongju135

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
尿素变性溶解蛋白，如果不用尿素的话，你的蛋白还在沉淀中的
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14楼2014-09-28 09:23:59
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by winterb at 2014-09-27 09:18:21
通常超声的时间是45秒，超声15秒间隔15秒.  洗脱是用尿素 +咪唑梯度洗脱.

我的菌体是用200ml菌液离心所得，超声 45秒根本超声不彻底，许多菌液还没有能够被裂解
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15楼2014-09-28 14:16:34
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yangyufeng88 at 2014-09-27 18:16:29
可能是buffer中有尿素导致包涵体溶解，可做WB验证目标蛋白是否表达

谢谢你的建议 ，我的蛋白表达没有问题。
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16楼2014-09-28 14:18:10
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by chongju135 at 2014-09-28 09:23:59
尿素变性溶解蛋白，如果不用尿素的话，你的蛋白还在沉淀中的

ok ，非常感谢你的帮助，我会换一种重新尝试的，
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17楼2014-09-28 14:20:12
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laojiu9878

至尊木虫 (文坛精英)

九牛

【答案】应助回帖

增大离心力，转速看看情况
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但愿人长久
18楼2014-09-28 14:56:50
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你应该改变破碎方式使用高压破碎. 超声破碎只是用在少量菌液.
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19楼2014-09-28 19:50:47
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

那说明表达在上清非包涵体。如果裂解液不含极端变性剂。

[ 发自小木虫客户端 ]
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20楼2014-09-28 20:26:33
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