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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化 已有8人参与

用镍柱进行蛋白纯化时，首先要获得菌体后裂解细胞，我选择的是超声破碎，我的蛋白是包涵体，但是我每次超声完后原来浑浊的菌体溶液都会变得清亮透明，离心以后几乎没有沉淀，不知道是怎么回事？难道是我超声的力度太大了，把包涵体都超声没啦？新手 请多帮忙
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1楼 2014-09-25 13:55:28
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是因为你加的尿素把包涵体溶解了，所以看不到沉淀。你可以这样，先把菌体用Tris-HCL缓冲液（pH8.0,不含尿素)悬浮，超声破碎后离心，去上清，沉淀用含8M 尿素的 20mM Tris-HCL,0.5M Nacl，pH8.0的缓冲液（为提高重组蛋白纯度，可在此缓冲液中加入10-40mM 咪唑）溶解。过滤后上镍柱纯化。
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24楼2014-09-29 09:11:40
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putao57819

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-25 20:59:38
不确定问题在哪里。建议增加培养的菌量，降低超声强度，取超声前，超声后的菌液，离心上清和离心沉淀跑电泳来确定问题在哪里。
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2楼2014-09-25 16:40:02
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非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-27 10:46:50
是不是超声功率太大 时间太长 即便蛋白是包涵体  菌体碎片 肯定会有离心下来的  再者是你转速太低 一般要13000rpm 30min 4℃离心 我们实验室做的话
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3楼2014-09-25 21:01:23
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winterb

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用什么样裂解液?
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4楼2014-09-26 08:45:19
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