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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 有木有谁建立细胞株的呀，求经验
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14_812

新虫 (小有名气)

[交流] 有木有谁建立细胞株的呀，求经验

将目的基因导入肿瘤细胞建立稳定表达该基因的细胞株，用药物G418进行筛选，但是效果不理想，在进行两次加药处理（约三天）后，对照组细胞（没有转染目的质粒的）竟然比实验组还多，这是为什么呢，求解，我按照之前老师做过的，细胞百分之八十进行转染，二十四小时后换液，二十四小时后加药筛选的。
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1楼 2014-08-17 12:04:44
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yuanyeguhong

至尊木虫 (文坛精英)
★
14_812(金币+1): 谢谢参与
路过的，瞅瞅！
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2楼2014-08-17 12:12:17
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)
★
14_812(金币+1): 谢谢参与
三天时间太短，也许细胞毒性作用尚未发挥，此时细胞多少无意义，至少给一个星期的时间再说。
另外，你所用的G418浓度是否合适，以前有否测试过？
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3楼2014-08-17 12:19:19
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for5

木虫 (正式写手)
★
14_812(金币+1): 谢谢参与
没一个月你想三天做好？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2014-08-17 13:03:11
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14_812

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-17 12:19:19
三天时间太短，也许细胞毒性作用尚未发挥，此时细胞多少无意义，至少给一个星期的时间再说。
另外，你所用的G418浓度是否合适，以前有否测试过？

噢，浓度一般是用的400
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12楼2014-08-17 15:59:16
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14_812

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by for5 at 2014-08-17 13:03:11
没一个月你想三天做好？

额，不是啊，只是觉得很奇怪啊，因为换了一次培基了
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13楼2014-08-17 16:00:45
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尘香驻风

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近也在做这个，我想说我从五月底到现在都还没做出来。。。当然，我是第一次做细胞，从零开始，问题多一点。我在筛选的时候也是开始细胞没有怎么死亡，约一个星期以后还是有很多，后来分析觉得是G418浓度太低了，加大浓度以后才看出来筛选效果。
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14楼2014-08-17 16:40:44
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yqbter

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1 不同细胞株对G418的耐受浓度时不一样的，即使相同细胞株，在不同实验室的耐受浓度也不会完全一致，更何况G418B不同厂家，不同批次的活性都是不一样的。所以在筛选之前，要摸索细胞株对G418的耐受浓度，一般是找连续培养2周，细胞刚好全死的浓度。
2 3天是看不出效果的，G418是抑制蛋白的合成，人如果2天不吃蛋白，只吃糖类，也不会死的。细胞也一样。3天就死，你也小看生命的韧性了。
3 对照组细胞（没有转染目的质粒的）竟然比实验组还多，可能的原因，如果G418的时间和浓度都很低，就不考虑G418的毒性。对照组的质粒少了目的基因，要产生的蛋白就少，代谢负荷就小，长得当然快了！
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15楼2014-08-17 16:45:30
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14_812

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by yqbter at 2014-08-17 16:45:30
1 不同细胞株对G418的耐受浓度时不一样的，即使相同细胞株，在不同实验室的耐受浓度也不会完全一致，更何况G418B不同厂家，不同批次的活性都是不一样的。所以在筛选之前，要摸索细胞株对G418的耐受浓度，一般是找连 ...

噢噢，谢谢你
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16楼2014-08-17 17:15:32
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cxjzly20084楼
2014-08-17 12:28   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
dmbb5楼
2014-08-17 12:31   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
shenrenren6楼
2014-08-17 12:48   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
tableman7楼
2014-08-17 12:52   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
ma-yue9楼
2014-08-17 13:26   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
chyzm10楼
2014-08-17 14:07   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
唐tjg11楼
2014-08-17 14:12   回复  
14_812(金币+1): 谢谢参与
14_81217楼
2014-08-17 17:16   回复  
引用回帖:
14楼: Originally posted by 尘香驻风 at 2014-08-17 16:40:44 我最近也在做这个，我想说我从五月底到现在都还没做出来。。。当然，我是第一次做细胞，从零开始，问题多一点。我在筛选的时候也是开始细胞没有怎么死亡，约一个星期以后还是有很多，后来分析觉得是G418浓度太低了， ...

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