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sakura01_22木虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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| 如题，在蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出，希望哪位虫友能帮忙解答一下。是否存在相互作用只能单方面pull-down的情况，这种情况如何解释？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
sakura01_22: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2014-08-19 10:35:21
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。现在多用精制的蛋白质A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A（protein A是一种特定的蛋白质，不是泛指，protein A和protein A都能够与抗体发生亲和的相互作用）， 然后洗出beads—Protein A，就能连带着吸附抗原达到精制的目的。这种研究方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定检测一种特定蛋白质的新的作用搭档。 原理部分是从从网上摘的，然后我根据楼主的问题的具体情况做了编辑（网上的帖子总是有错！想偷懒都很难  ），没有别的意思，就是我自己偷懒想打点字。  正如六楼的jurkat.1640说的“顺便说一下你这个不叫pull-down”，楼主的方法就叫免疫共沉淀，与pull-down是两种不同的方法。 言归正传，既然，楼主在5楼已经否认是假阳性，那么假阳性的问题就不讨论了。 要解决:蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白X能拉下蛋白Y，但是蛋白Y IP蛋白X时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出 的问题，就要仔细对比两次的免疫共沉淀的X和Y的具体反应条件有什么区别？(因为我的叙述中有抗体识别蛋白质protein A，所一把搂主的两个蛋白质改称为X和Y，以免混淆） 显然，楼主两次试验的两次的抗体分别是抗X的抗体和抗第Y的抗体，楼主的两次试验没有同时成功，因为本实验本身就有系统误差，即假定：X与Y彼此发生非共价的相互作用时，彼此的抗原免疫簇都还是完好的，没有空间位阻的。实际上果真如此吗？不可能每一次都这样幸运。 蛋白质-蛋白质相互作用的条件 蛋白质-蛋白质相互作用是一种分子识别过程，符合分子识别的一般原理。分子识别是通过两种蛋白质分子各自的彼此对应的结合部位来实现的。要实现分子识别，就一般具备下列四个条件： 1）在两种蛋白质分子的结合部位之间，其微区构象要能够相嵌互补，造成相当大的接触面积，或者经过构象变化达到这一目的。 2）两个结合部位各有相应的化学基团，相互之间能产生足够的结合力，使两种蛋白质分子结合起来。 3）一般而言，多亚基的蛋白质解离后没有生物功能，但是也有一些例外，比如G蛋白。 4）疏水相互作用是蛋白质-蛋白质联系的主要作用力，相互作用区域主要有两种结构---------疏水核（一般为β折叠）或者1到3 个疏水的氨基酸残基团。 ————参考文献： Bengt Nölting,Protein Folding Kinetics-Biophysical Methods，Springer, 2006,29-34, 162-164； 陶慰孙 等. 蛋白质分子基础,高等教育出版社，1995,334； M.C.Lawrence, P.M.Colman. Shape Complentarity at Protein-protein Interface, J.Mol.Biol.1993,234:946-950 ； 分子识别的过程是通过两种蛋白质分子各自的彼此对应的结合部位来实现的条件的第一条和第二条也同时是蛋白质-蛋白质相互作用的结果，蛋白质-蛋白质相互作用的结果至少还有一条：发生相互作用的蛋白质的分子表面空间必然受到另一个蛋白质的遮挡而产生空间位阻和一定程度上的重新折叠。 针对楼主的实验： 如果蛋白质X和蛋白质Y发生了相互作用，而蛋白质X的分子表面的抗原免疫簇，既没有受到空间位阻的遮挡，也没有因为X可能发生了部分重折叠而改变了抗原免疫簇，那么用抗X蛋白质的抗体当然可以用免疫共沉淀检测出X-Y发生了相互作用，因为抗蛋白质X的抗体与蛋白质X顺利的发生了免疫识别，而后抗蛋白质X的抗体又被beads—Protein A上的识别抗体的Protein A给粘上。 但是如果蛋白质X和蛋白质Y发生了相互作用，而蛋白质Y的分子表面的抗原免疫簇，受到空间位阻的遮挡，或者蛋白质Y的分子表面的抗原免疫簇干脆就在X与Y两者的接触面里，这时后加入细胞裂解液里的抗Y蛋白质的抗体上哪里去和蛋白质Y发生免疫识别（没有抗原免疫簇或者难以接近抗原免疫簇），尤其是抗Y蛋白质的抗体是单克隆抗体时，其识别的抗原免疫簇是唯一的。做个不太恰当的比喻：小三虽然有魅力，但是原配夫人在场时一般还是没有可能上位的。 又或者Y在X相互作用过程中，Y可能发生了部分重折叠而改变了Y分子表面的抗原免疫簇，那么在第二种情况下，用抗Y蛋白质的抗体肯定无法免疫共沉淀检测出X-Y发生了相互作用，洗出来就是：抗Y蛋白质的抗体—Protein A—beads，没有蛋白质X和蛋白质Y两位主角的事情了，那实验当然失败了。 |
8楼2014-08-19 01:30:50
凌波丽
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
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下面提供给楼主解决问题的方法： 蛋白质-蛋白质相互作用的方法有的是，最省事的就是直接用分子生物学软件预测，再有：In Vivo Protein Cross-Linking,Mapping Protein-Ligand Interactions by hydroxyl-Radical Protein Footprinting,用MALDI-MS也可以，这些实验都不费事。 请参考：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版）： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403 的第15章、第29章、第34章、第35章，还有使用各种光谱方法也行。 In Vivo Protein Cross-Linking还可以参考：GregT. Hermanson，Bioconjugate Techniques(2013,3rd edition) http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6709686 另外，在下在论坛里发过两篇蛋白质—多肽相互作用的长文，其研究方法也适用于 蛋白质-蛋白质相互作用，楼主可以参考。 1.确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957 2.多 肽 受 体 研 究 咨 询 与 回 复——凌波丽 个人总结 第五季 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7728986 |
9楼2014-08-19 01:55:36
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有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！免疫识别发生在细胞尚未裂解时！！！而后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。 ”The procedure for immunoprecipitation is outlined in Fig. 1. In the first step, cells are transfected with plasmids coding for a bait protein and its potential ligand, the target protein. These cells are lysed with a gentle detergenttreatment, creating a lysate containing bait–target complexes along with many irrelevant proteins. A capture antibody that specifically recognizes the bait protein is added to the lysates, forming a new antibody–bait–target complex. The antibody is then used as a handle to immobilize the proteins on inert Sepharose beads that are covalently coupled to Protein A, which stably binds the constant regions of many types of antibodies. At this point, those proteins not immobilized on beads are removed by a series of washes. Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338. |
18楼2014-08-20 12:39:57
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更正：有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！蛋白质-蛋白质相互作用（不是免疫识别，上面写错了）发生在细胞尚未裂解时！！！而后裂解细胞，然后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。 “Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338.”是在上图的最后一步;"The beads are then washed free of irrelevant proteins, and the antibody, bait, and target are eluted by boiling."蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果能够实现，都在煮沸洗脱和WB之前就完成了，如果蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果不能够实现，煮沸洗脱和WB就更加不会使得"蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别实现。请搞清楚实验流程的顺序！ |
20楼2014-08-20 12:52:08
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