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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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sakura01_22

木虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出

如题，在蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出，希望哪位虫友能帮忙解答一下。是否存在相互作用只能单方面pull-down的情况，这种情况如何解释？
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心怀希望，放飞梦想！
1楼2014-08-17 11:30:45
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-19 01:30:50
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） ...

蛋白结合以后可能会遮挡抗原决定簇的观点很有启发性，但跑胶时加上样缓冲液又煮沸的过程，大部分蛋白质X和蛋白质Y的相互作用都会分开的吧，因此即使两种蛋白结合过程中遮盖了抗原决定簇，也不会影响到抗体检测蛋白质吧。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
15楼2014-08-20 10:16:15
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dingchaoyue

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:26
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:46
可否用pull-down的方法严重一下b是否可以拉下a？你的那种情况我们组里面有人也出现过那种情况，后来用纯化蛋白用pull down方法解决的，而不是用抗体。当然，还有可能那两蛋白不互作，有a拉b的假阳性。
蛋白互作能否用bifc方法来试试？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-08-17 11:48:47
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
这种情况虽然少见，但却是可以出现的。具体到你的情况：
1、确证用A之抗体Co-IP B的真实性，具体说要有对照（同种属的control IgG对照）。
2、另选一种或几种B的抗体试一试。许多抗体并非适于IP实验，这时只能另选可能用的其他抗体。
3、用其他方法验证A-B间的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。
4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B间的相互作用。

Good luck！
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3楼2014-08-17 12:11:30
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sakura01_22

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingchaoyue at 2014-08-17 11:48:47
可否用pull-down的方法严重一下b是否可以拉下a？你的那种情况我们组里面有人也出现过那种情况，后来用纯化蛋白用pull down方法解决的，而不是用抗体。当然，还有可能那两蛋白不互作，有a拉b的假阳性。
蛋白互作能否 ...

GST-pull down和BIFC摸索起来都挺费时间的，我本来想用体内试验证明一下二者有相互作用，谁知道出现这种诡异的情况，anyway，谢谢亲的回复！
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心怀希望，放飞梦想！
4楼2014-08-18 16:50:35
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