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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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sakura01_22

木虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出

如题，在蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出，希望哪位虫友能帮忙解答一下。是否存在相互作用只能单方面pull-down的情况，这种情况如何解释？
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心怀希望，放飞梦想！
1楼 2014-08-17 11:30:45
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-08-19 20:40:14
下面提供给楼主解决问题的方法：

蛋白质-蛋白质相互作用的方法有的是，最省事的就是直接用分子生物学软件预测，再有：In Vivo Protein Cross-Linking,Mapping Protein-Ligand Interactions by hydroxyl-Radical Protein Footprinting,用MALDI-MS也可以，这些实验都不费事。
请参考：Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版）：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403
的第15章、第29章、第34章、第35章，还有使用各种光谱方法也行。

In Vivo Protein Cross-Linking还可以参考：GregT. Hermanson，Bioconjugate Techniques(2013,3rd edition)
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6709686

另外，在下在论坛里发过两篇蛋白质—多肽相互作用的长文，其研究方法也适用于 蛋白质-蛋白质相互作用，楼主可以参考。
1.确定蛋白质—多肽相互作用结合位点的实验设计：凌波丽个人总结之二
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6739957
2.多 肽 受 体 研 究 咨 询 与 回 复——凌波丽 个人总结 第五季
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7728986
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9楼2014-08-19 01:55:36
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dingchaoyue

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:26
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:46
可否用pull-down的方法严重一下b是否可以拉下a？你的那种情况我们组里面有人也出现过那种情况，后来用纯化蛋白用pull down方法解决的，而不是用抗体。当然，还有可能那两蛋白不互作，有a拉b的假阳性。
蛋白互作能否用bifc方法来试试？

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2楼2014-08-17 11:48:47
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
这种情况虽然少见，但却是可以出现的。具体到你的情况：
1、确证用A之抗体Co-IP B的真实性，具体说要有对照（同种属的control IgG对照）。
2、另选一种或几种B的抗体试一试。许多抗体并非适于IP实验，这时只能另选可能用的其他抗体。
3、用其他方法验证A-B间的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。
4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B间的相互作用。

Good luck！
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3楼2014-08-17 12:11:30
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sakura01_22

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingchaoyue at 2014-08-17 11:48:47
可否用pull-down的方法严重一下b是否可以拉下a？你的那种情况我们组里面有人也出现过那种情况，后来用纯化蛋白用pull down方法解决的，而不是用抗体。当然，还有可能那两蛋白不互作，有a拉b的假阳性。
蛋白互作能否 ...

GST-pull down和BIFC摸索起来都挺费时间的，我本来想用体内试验证明一下二者有相互作用，谁知道出现这种诡异的情况，anyway，谢谢亲的回复！
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心怀希望，放飞梦想！
4楼2014-08-18 16:50:35
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