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sakura01_22木虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白质相互作用研究 蛋白A能pull-down蛋白B 反之检测不出
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| 如题，在蛋白质相互作用研究中，IP检测，蛋白A能拉下蛋白B，但是蛋白B IP蛋白A时，检测不出。重复3遍左右，依然检测不出，希望哪位虫友能帮忙解答一下。是否存在相互作用只能单方面pull-down的情况，这种情况如何解释？ |
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更正：有人还是先去看看免疫共沉淀的实验的原理吧！蛋白质-蛋白质相互作用（不是免疫识别，上面写错了）发生在细胞尚未裂解时！！！而后裂解细胞，然后是抗其中一个蛋白质的单抗与其中一个蛋白质发生免疫识别！这步能够使蛋白质变性吗！！？？变性了还免疫识别个鬼呀！除非免疫簇就是序列免疫簇。 “Finally, the bait-protein complexes are eluted from the beads and dissociated by boiling in SDS. The presence or absence of the target protein, which is the endpoint of the assay, is evaluated by Western blot.“——————Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions:Methods and Applications,Humana Press,2004，338.”是在上图的最后一步;"The beads are then washed free of irrelevant proteins, and the antibody, bait, and target are eluted by boiling."蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果能够实现，都在煮沸洗脱和WB之前就完成了，如果蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别，如果不能够实现，煮沸洗脱和WB就更加不会使得"蛋白质-蛋白质相互作用还是免疫识别实现。请搞清楚实验流程的顺序！ |
20楼2014-08-20 12:52:08
dingchaoyue
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2楼2014-08-17 11:48:47
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【答案】应助回帖
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sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
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sakura01_22(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:28:38
sakura01_22: 金币+2 2014-08-19 10:34:54
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这种情况虽然少见，但却是可以出现的。具体到你的情况： 1、确证用A之抗体Co-IP B的真实性，具体说要有对照（同种属的control IgG对照）。 2、另选一种或几种B的抗体试一试。许多抗体并非适于IP实验，这时只能另选可能用的其他抗体。 3、用其他方法验证A-B间的相互作用（physical interaction），如GST pulldown assays等。 4、可以用mammalian two-hybrid assay在功能上（functional interaction）研究A-B间的相互作用。 Good luck！ |
3楼2014-08-17 12:11:30
sakura01_22
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4楼2014-08-18 16:50:35
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