应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢
101/1返回列表
查看: 4772  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

pcwcp

铜虫 (初入文坛)

[求助] 真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢 已有4人参与

请教一下表达载体构建的问题。。我构建了两个真核表达载体分别为pcDNA3.1(+)及pcMV-myc，要表达的目的蛋白为（序列1527bp大小），55kD大小的糖蛋白，载体构建测序正确，以空载体作为对照，脂质体2000转染293以及293T细胞western blot结果都显示不表达。现在非常郁闷，不知道问题出自哪里。希望您帮助分析一下。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-08-11 14:56:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-11 20:16:24
首先确定western blot方法是工作的，要有阳性对照，之前我们遇到过这种情况，我们没有阳性对照样品，折腾了好久，换了一家买抗体就行了
赞一下 回复此楼
2楼2014-08-11 15:09:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pcwcp

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hutingting at 2014-08-11 15:09:24
首先确定western blot方法是工作的，要有阳性对照，之前我们遇到过这种情况，我们没有阳性对照样品，折腾了好久，换了一家买抗体就行了

一抗体是横向课题另外一个研究所制备的多抗，应该没问题。二抗我也换了两家了，用的是sigma的。。现在的关键是跑page没有目的条带。。蛋白不表达。
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-11 15:21:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-11 20:16:51
1. 表达的目的蛋白应该在哪里，是分泌性抗体吗？
2. 你用的试剂盒吧，联系厂家。
3. 试剂是否受损过，比如冰箱停电什么的。
祝好远！
赞一下 回复此楼
需要金币
4楼2014-08-11 17:38:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
pcwcp(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:45:47
另外可能还有一个原因，是不是你的IRES序列出问题了，就是核糖体中部进入位点。
赞一下 回复此楼
需要金币
5楼2014-08-11 17:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pcwcp

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2014-08-11 17:40:08
另外可能还有一个原因，是不是你的IRES序列出问题了，就是核糖体中部进入位点。

重新分析了测序结果，终止密码子少了一个碱基。。。哎
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-12 22:01:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flesymgo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pcwcp at 2014-08-12 22:01:24
重新分析了测序结果，终止密码子少了一个碱基。。。哎...

楼主补上终止密码子就表达了吗？
赞一下 回复此楼
做现在能做的,想现在该想的.
7楼2014-08-29 15:45:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

查无此人lyp

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我也遇到了相同的问题，是病毒的囊膜糖蛋白，2300多bp，后面插入了荧光蛋白基因，观察不到荧光，WB也做了也检测不到蛋白，测序正确，不知道怎么办了，是不是因为信号肽或其他调节基因被去掉了影响了蛋白的表达？不知道楼主的问题解决了没有？可否告知解决方法？
赞一下 回复此楼
8楼2015-03-20 10:36:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

放完气的可乐

新虫 (初入文坛)
本人愚见，可能是你的蛋白还受到别的调控机制才能表达
赞一下 回复此楼
9楼2015-03-21 09:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

无论是真核蛋白表达纯化还是原核表达纯化，一般在表达方面不会出现大问题，如果不表达，最好从基因合成就开始考虑，密码子的偏好性不同在不同的表达系统中表达，需要合成不同的序列，所以还是从基因入手吧，我对真核表达不是很了解，但是表达的本质应该是一样的吧。。。
赞一下(1人) 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-07-15 13:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 pcwcp 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 10/500 2026-08-23 07:17 by OEbVnUOu01ol
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:43 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +11 羊腰板 2026-08-21 11/550 2026-08-22 22:03 by lsbin3733
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭