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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢
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pcwcp

铜虫 (初入文坛)

[求助] 真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白，大家帮忙分析一下原因谢谢 已有4人参与

请教一下表达载体构建的问题。。我构建了两个真核表达载体分别为pcDNA3.1(+)及pcMV-myc，要表达的目的蛋白为（序列1527bp大小），55kD大小的糖蛋白，载体构建测序正确，以空载体作为对照，脂质体2000转染293以及293T细胞western blot结果都显示不表达。现在非常郁闷，不知道问题出自哪里。希望您帮助分析一下。
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1楼 2014-08-11 14:56:15
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-11 20:16:24
首先确定western blot方法是工作的，要有阳性对照，之前我们遇到过这种情况，我们没有阳性对照样品，折腾了好久，换了一家买抗体就行了
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2楼2014-08-11 15:09:24
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pcwcp

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hutingting at 2014-08-11 15:09:24
首先确定western blot方法是工作的，要有阳性对照，之前我们遇到过这种情况，我们没有阳性对照样品，折腾了好久，换了一家买抗体就行了

一抗体是横向课题另外一个研究所制备的多抗，应该没问题。二抗我也换了两家了，用的是sigma的。。现在的关键是跑page没有目的条带。。蛋白不表达。
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3楼2014-08-11 15:21:16
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-11 20:16:51
1. 表达的目的蛋白应该在哪里，是分泌性抗体吗？
2. 你用的试剂盒吧，联系厂家。
3. 试剂是否受损过，比如冰箱停电什么的。
祝好远！
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4楼2014-08-11 17:38:37
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
pcwcp(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:45:47
另外可能还有一个原因，是不是你的IRES序列出问题了，就是核糖体中部进入位点。
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5楼2014-08-11 17:40:08
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pcwcp

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2014-08-11 17:40:08
另外可能还有一个原因，是不是你的IRES序列出问题了，就是核糖体中部进入位点。

重新分析了测序结果，终止密码子少了一个碱基。。。哎
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6楼2014-08-12 22:01:24
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flesymgo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pcwcp at 2014-08-12 22:01:24
重新分析了测序结果，终止密码子少了一个碱基。。。哎...

楼主补上终止密码子就表达了吗？
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做现在能做的,想现在该想的.
7楼2014-08-29 15:45:50
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查无此人lyp

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我也遇到了相同的问题，是病毒的囊膜糖蛋白，2300多bp，后面插入了荧光蛋白基因，观察不到荧光，WB也做了也检测不到蛋白，测序正确，不知道怎么办了，是不是因为信号肽或其他调节基因被去掉了影响了蛋白的表达？不知道楼主的问题解决了没有？可否告知解决方法？
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8楼2015-03-20 10:36:49
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放完气的可乐

新虫 (初入文坛)
本人愚见，可能是你的蛋白还受到别的调控机制才能表达
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9楼2015-03-21 09:18:43
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

无论是真核蛋白表达纯化还是原核表达纯化，一般在表达方面不会出现大问题，如果不表达，最好从基因合成就开始考虑，密码子的偏好性不同在不同的表达系统中表达，需要合成不同的序列，所以还是从基因入手吧，我对真核表达不是很了解，但是表达的本质应该是一样的吧。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-07-15 13:38:35
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