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pcwcp

铜虫 (初入文坛)

[求助] 真核表达载体构建成功但是不表达目的蛋白,大家帮忙分析一下原因谢谢 已有4人参与

请教一下表达载体构建的问题。。我构建了两个真核表达载体分别为pcDNA3.1(+)及pcMV-myc,要表达的目的蛋白为(序列1527bp大小),55kD大小的糖蛋白,载体构建测序正确,以空载体作为对照,脂质体2000转染293以及293T细胞western blot结果都显示不表达。现在非常郁闷,不知道问题出自哪里。希望您帮助分析一下。
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查无此人lyp

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我也遇到了相同的问题,是病毒的囊膜糖蛋白,2300多bp,后面插入了荧光蛋白基因,观察不到荧光,WB也做了也检测不到蛋白,测序正确,不知道怎么办了,是不是因为信号肽或其他调节基因被去掉了影响了蛋白的表达?不知道楼主的问题解决了没有?可否告知解决方法?
8楼2015-03-20 10:36:49
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-11 20:16:24
首先确定western blot方法是工作的,要有阳性对照,之前我们遇到过这种情况,我们没有阳性对照样品,折腾了好久,换了一家买抗体就行了
2楼2014-08-11 15:09:24
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pcwcp

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hutingting at 2014-08-11 15:09:24
首先确定western blot方法是工作的,要有阳性对照,之前我们遇到过这种情况,我们没有阳性对照样品,折腾了好久,换了一家买抗体就行了

一抗体是横向课题另外一个研究所制备的多抗,应该没问题。二抗我也换了两家了,用的是sigma的。。现在的关键是跑page没有目的条带。。蛋白不表达。
3楼2014-08-11 15:21:16
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-08-11 20:16:51
1. 表达的目的蛋白应该在哪里,是分泌性抗体吗?
2. 你用的试剂盒吧,联系厂家。
3. 试剂是否受损过,比如冰箱停电什么的。
祝好远!
需要金币
4楼2014-08-11 17:38:37
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