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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 蛋白印迹遇到的问题，求解答
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妙语1989

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白印迹遇到的问题，求解答 已有1人参与

1、3，4月份的时候电泳时间一直是1.5-2小时，且跑出来的样品压的比较细，呈直线。7月以后电泳时间一般有3-4小时，且跑出来的样品比较粗，一边快一边慢。有时电泳液变蓝。电泳完后，玻片比较热。估计电泳液温度在50-60度之间。我的电泳液都只使用一次，配方也未变，不知道是不是温度影响，可不可以冰浴低温电泳。
2、我的一抗都是用碧云天的一抗稀释液稀释后反复使用的，有一个蛋白，一抗特异性不强，背景较深，但奇怪的是，第一次配的一抗背景不深，往后的越来越深。这是什么原因呢。
3、荧光淬灭，蛋白表达量较低，所以会压的比较久一点，用碧云天的ECL化学发光液发荧光时间约为1-2小时，这次换了博士德的，压了5分钟就看不到Actin了。荧光淬灭的情况如何解决呢？
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1楼 2014-07-31 15:25:57
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xiaomili1206

新虫 (初入文坛)
Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面：含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂，人们多注意了抗体，不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题；对发光试剂来说，可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。
英格恩的ECL发光液有独特的发光配方，发光时间长达几小时以上，轻松进行曝光操作。并含独特的发光稳定剂，4℃储存1年以上，信号强度不变。
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3楼2015-08-24 16:08:45
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

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妙语1989(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:23:05
妙语1989: 金币+7, ★★★很有帮助, 谢谢，昨天冰浴跑电泳，跑出来的条带好好看。再看今天的结果怎么样了 2014-08-02 09:57:42
1可以用冰浴低温电泳，我以前跑电泳，夏天太热，开着空调还不行，于是把电泳槽放到4度冷藏柜里去跑（电源之类的当然要放外面，不然4度冷凝进水就危险了。）
2一般情况下，一抗最好不要重复使用。个人感觉，反复使用后，里面的杂质越来越多，会形成背景的
3荧光淬灭这个比较麻烦，有条件的话，买个看胶的软件，可以控制曝光时间。我觉得压胶片太考验技术了。少加点ecl会发光长点貌似。
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天行健
2楼2014-08-01 09:24:02
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