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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 质量控制 » 内毒素干扰实验，有些不理解，求组各路朋友帮忙解惑。
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protein780

铁虫 (小有名气)

[求助] 内毒素干扰实验，有些不理解，求组各路朋友帮忙解惑。已有2人参与

1.药典上说用未检查出内毒素的供试品稀释标准品，我的样品从未做过检测，怎么可能知道是否含有内毒素呢？
2.我跳过干扰实验直接做凝胶限量实验，发现样品在最大稀释范围与鲎试剂反应时仍未阳性，这个怎么排除是否是因为有干扰增强的因素呢？
3.抗体类药物在生产时内毒素最大限值是多少呢？有的说10EU/剂量，是这样的吗？
4.干扰实验的原理是什么呢？“通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰”，这一说法，我不太明白，供试品里面肯定会有一部分内毒素的呀，再加入标准品，肯定会增加呈现阳性的概率。
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1楼2014-07-25 10:27:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

绿茶清羽

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
protein780: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-25 17:12:05
1、个人认为，这个“未检查出内毒素的供试品稀释标准品”指的是：在做干扰实验之前，肯定会做相应干扰预实验来确定供试品的合适浓度，而在此浓度下的供试品，用你确定的鲎试剂实验之后是不会有阳性反应的。也就是，此浓度的供试品，内毒素含量应是在你定的限值以内的；
2、你做供试品阳性反应了吗？如果做了，阳性反应不是阳性的话，才能证明你的供试品对结果是有干扰的。你可以检测一下PH值，看是否在合适的PH值范围内，像枸橼酸、组氨酸等等的PH干扰都很大；
3、内毒素限值是根据药典上的公式算出来的，如果觉得药典上的限值过大，可参考同类产品的内毒素限值，个人认为，严格一些是好事。并不是所有的抗体类药物的内毒素限值都是10EU/剂量；
4、这个就是一个回收实验。检查一下你选择的供试品浓度是否对鲎试剂反应无干扰。一般
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加油！！！！！！！！！！！！
3楼2014-07-25 14:28:04
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农场小猪

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
protein780: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-07-28 12:15:29
楼主这帖子发出来 问题大了
内毒素试验干扰试验是重中之重，不做干扰试验，内毒素完全可以别去做了。
1.楼主你说你的最大稀释倍数仍有干扰，首先你干扰试验就没做，你选用的鲎试剂灵敏度是多少。0.015到0.25都是，你选用的鲎试剂不同。你的最大稀释倍数和浓度也不一样，你本身直接操作就是盲目的错误。
2. 内毒素并不是所有品种都合适，你的PH范围在2到8么，你的样品中是否有高价金属离子这样的直接会和鲎试剂螯合，你内毒素试验如果要用到0.015 0.03的灵敏度鲎试剂才可以做的话，你就要去做热原了。
3.内毒素限度时通过你的说明书给药途径，给药量来计算的，药典上也说明了，考虑到联合用药。你的内毒素限度应该放到你计算限度的一半或者1/3.
楼主的1.4点是一个问题，干扰试验，供阳肯定要凝固，鲎试剂0.125eu相当于溶液加入这个鲎试剂，其中内毒素有0.125它就能凝固。
也就是说3中以下情况，对照凝固，供阳凝固，供试不凝固，水不凝固 你无干扰
                     对照凝固，供阳不凝固，供试不凝固，水不凝固 有干扰
                     对照凝固，供阳凝固，供试凝固，水不凝固 有干扰
你的第一点药典的意思就是你的供试品和标准品配制时。你的供试品浓度下溶液不会干扰鲎试剂。
个人觉得楼主与其急做试验，不如先慢下来，看看药典和操作规程在做，我上面写的都是药典里的，您现在的试验说难听的就是瞎做，浪费时间啊
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6楼2014-07-26 13:59:53
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普通回帖

protein780

铁虫 (小有名气)
有没有了解的朋友给个帮助呢？
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2楼2014-07-25 12:28:16
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protein780

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 绿茶清羽 at 2014-07-25 14:28:04
1、个人认为，这个“未检查出内毒素的供试品稀释标准品”指的是：在做干扰实验之前，肯定会做相应干扰预实验来确定供试品的合适浓度，而在此浓度下的供试品，用你确定的鲎试剂实验之后是不会有阳性反应的。也就是， ...

谢谢，非常感谢，另外，你有抗体类药物内毒素限值的数据吗？我查不到呢，能否给我说一些，不用多，我参考下，hdsdau@163.com
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4楼2014-07-25 17:02:30
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giksgdjbkj

新虫 (初入文坛)
其实本质是比对鲎试剂反应吧，根据药典的计算式没错的，前提是你的供试品浓度要合适
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5楼2014-07-26 09:53:56
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protein780

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 农场小猪 at 2014-07-26 13:59:53
楼主这帖子发出来 问题大了
内毒素试验干扰试验是重中之重，不做干扰试验，内毒素完全可以别去做了。
1.楼主你说你的最大稀释倍数仍有干扰，首先你干扰试验就没做，你选用的鲎试剂灵敏度是多少。0.015到0.25都是， ...

首先，非常非常感谢指导，我是有些着急的，关于我的实验，我想补充下，我做了干扰的预实验，做了四个梯度的浓度，想做一个干扰的预实验，找到一个合适浓度范围既最小稀释倍数，再做干扰实验，结果是所有浓度下鲎试剂反应均为阳性，其他三组没有问题，所以不是我不想做干扰实验，是实在是找不到合适的浓度啊，现在应该是只能选择更高灵敏度的鲎试剂，增加稀释倍数了。您觉得呢？
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7楼2014-07-28 09:21:59
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农场小猪

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by protein780 at 2014-07-28 09:21:59
首先，非常非常感谢指导，我是有些着急的，关于我的实验，我想补充下，我做了干扰的预实验，做了四个梯度的浓度，想做一个干扰的预实验，找到一个合适浓度范围既最小稀释倍数，再做干扰实验，结果是所有浓度下鲎试 ...

你用的是多少灵敏度的在做，是的 都是阳性，可能是要增加倍数了 换高灵敏度的。问题还是那些。
首先鲎试剂必须在有2价的Mg Ca存在下参与激活才能发生凝固，你都是阳性，看来你样品不会是碱性大于10的，不会出现假阴性。但是你的样品是否本身就会和鲎试剂螯合呢，达托酶素就是的，你怎么做都是阳性，因为它直接就可以和鲎试剂螯合，问题还是我说的，你要先文献查阅你的是否能做内毒素。不能做只能做热原
你换了高灵敏度的鲎试剂，换到哪些，0.03你就必须要做热原了。
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8楼2014-07-28 09:43:31
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protein780

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 农场小猪 at 2014-07-28 09:43:31
你用的是多少灵敏度的在做，是的 都是阳性，可能是要增加倍数了 换高灵敏度的。问题还是那些。
首先鲎试剂必须在有2价的Mg Ca存在下参与激活才能发生凝固，你都是阳性，看来你样品不会是碱性大于10的，不会出现假 ...

我现在用的是0.25EUl的鲎试剂，样品pH7左右，样品是抗体类药物，不是道是否会与鲎试剂螯合，也许纯化过程中不够严格，下次实验的样品我打算过滤除菌再试试，接下来想选用0.03EU的鲎试剂，0.03就必须做热源了吗？请问，有相关的规定吗？
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9楼2014-07-28 11:05:26
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农场小猪

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by protein780 at 2014-07-28 11:05:26
我现在用的是0.25EUl的鲎试剂，样品pH7左右，样品是抗体类药物，不是道是否会与鲎试剂螯合，也许纯化过程中不够严格，下次实验的样品我打算过滤除菌再试试，接下来想选用0.03EU的鲎试剂，0.03就必须做热源了吗？请 ...

是的 药典上有明确规定，你看下操作规程，上面有明确说明，鲎试剂灵敏度使用0.03或者更低的时候，需要做热原。0.25的太高了 你试试0.06的看看不行再说，还有你看下你的鲎试剂厂家，你最好用湛江或者湛江安度斯的 厦门的不是很推荐，那个鲎试剂现在做的不好，我们江苏这里省所基本上都不用厦门那家的了，都是推荐安度斯。你再试试，查查文献再，PH是没问题的。实在0.06的也做不了又干扰，你还只能去做热原 这也没办法
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protein780
10楼2014-07-28 18:06:56
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