24小时热门版块排行榜

返回列表

xiehe_ai

金虫 (著名写手)

额

应助: 0 (幼儿园)
贵宾: 0.09
金币: 58.5
散金: 2293
红花: 29
沙发: 2
帖子: 1320
在线: 533.6小时
虫号: 868149
注册: 2009-10-11
性别: GG
专业: 无神论

[交流] 关于亲和色谱，你真正了解多少？已有6人参与

此文是某书的节选，我放在这，旨在提高大家对亲和层析缺陷的认识，欢迎大家讨论交流。
   亲和色谱被认为是理想的色谱法，它具有特异性高，操作简便的优点；通过加样、预洗、洗脱纯化产物。高特异性和简便性的代价往往很高，但这并不是指介质本身的价格。亲和色谱含有很多复杂的因素，在纯化过程中具有极为重要的作用，如果忽视了这些复杂因素，付出的代价会更高。
1.产物变性
         产物变性是亲和色谱法最严重且长期存在的问题之一。这种现象在配体亲和力较强、需要苛刻的条件洗脱产物时尤其明显。洗脱时常选择低pH的条件，最典型的是pH2.5～3.0。研究表明蛋白质暴露在这种条件下会发生永久性的构象改变。正常情况下疏水残基被隐藏在一级结构域内部，但在洗脱条件下就暴露出来了，蛋白质与柱子非特异疏水性结合相应增加。此外，另一个后果就是蛋白质发生聚合的概率上升，亲和纯化后用分子筛分离蛋白质可以很容易地证明这一点。
      构象改变后还有一个常见但不十分明显的现象：产物蛋白质的水解率增加。蛋白质水解程度轻而人们往往注意不到，但这个问题仍然广泛存在。最隐蔽也最容易被忽视的问题是二级结构效应器的修饰现象。抗体就是一个很好的例子：抗体分子的非抗原结合区域含有大量与各种蛋白质、糖类和免疫细胞结合的受体。受体发生构象修饰后，其功能也会发生改变。所有这些提高增加蛋白质的聚合性、裂解性和改变效应器功能的因素都可以（可能）引起改变产物的有效性、安全性和药物代谢动力学性质的变化，甚至改变蛋白质的治疗功能。因此应该在选择洗脱条件时考虑到以上因素。
      解决上述问题的方法之一是选择较温和的洗脱条件。第一个反对此方法的意见是： “如果用较温和的pH，洗脱的效率就会降低。”实际上适当的升高pH也可以可能完全不影响洗脱效率，当然这样需要投入精力寻找有效的pH的范围。如果只改变pH而不影响产率，就有很多机会了。生物亲和性是由疏水作用力、电荷作用、氢键和其他机制复合作用而介导的，十分复杂。低pH可以扭曲蛋白质分子，使之变形而无法与配体结合，除此之外还可以利用一个或多个其他作用机制来洗脱。当然只靠这些无法构成有效的洗脱，但却可以改善洗脱蛋白质所需的苛刻pH条件。例如50％的乙烯乙二醇能够降低疏水作用。这个浓度下的乙烯乙二醇对于大部分蛋白质都是稳定的，同时蛋白质的极性也能大幅度非常有效地降低蛋白质的极性。乙烯乙二醇为非离子性分子，对下游的电荷纯化方法也没有影响。再如，1mol/L尿素可断开氢键作用，这个浓度的尿素对蛋白质构象的影响极小，而且和乙烯乙二醇一样，它也是非离子性的。0.5～1mol/L的尿素足以屏蔽一切电荷作用，且不会明显增强疏水作用。也可以用相同浓度的促溶性盐如高氯酸钠代替尿素，促溶性盐不仅仅能屏蔽电荷作用，它的促溶性还可以削弱电荷作用。
      采取这些措施后可以提高洗脱液一个pH单位，一般来说这已经足够了。但是产生了一个不可避免的问题：采取上述措施会不会与单独用pH洗脱一样引起蛋白质的变性？答案是不会。试想一下，如果你要将一块钉在墙上的橡木板取下来移作他用，木板用螺丝钉拧紧在墙上，用钉子钉着，还用胶水粘着。如果只用一根撬棍想要完好无损地撬开木板的可能性很小，但若是先除去螺丝和钉子，再用热水浸湿胶粘处，使之松动，就可以轻松的取下木板，且损伤木板的可能性也减少了。但第二个障碍又产生了：这些操作抵消了亲和色谱的简便性。经典的研究主要注重的是亲和反应机制，但是也需要通过实验来建立有效且变性率低的洗脱缓冲液。
      尽管人们投入了很大力量建立不引起变性的洗脱缓冲液，但仍然会发现洗脱产物具有易于聚合和水解的倾向，或者一级结构、二级结构功能受到修饰的现象。事实就是这样残酷，变性在某种程度上是不可避免的。对亲和反应的研究一致表明，结合反应发生时会伴随出现一种被称为诱导契合的现象。诱导契合是指当反应物相遇时，不仅亲和配体，还有受体都会发生构象改变，使两个分子牢牢锁住。诱导契合最好的证据之一是产物与配体可以在温和的条件下结合，但想分开它们却需要相当严格的条件。有一个最好的例子如Protein A与IgG的结合，Protein A结合在Cg2和Cg3结构域间的疏水裂隙内，X射线晶体衍射数据显示Cg3在分子接触后不受影响，但Cg2结构域向Protein A和Cg2纵向移动。除了结合区域的构象改变，结合反应还使受体富集的末端第三Cg2结构域发生变化，这会引起Cg2之间的糖结构的局部旋转和不稳定，且这些影响是永久性的。不管如何小心选择洗脱条件，纯化后的产物与未经亲和色谱的对照物相比，蛋白质的行为特征的改变总是可检测到。但这并不意味着建立温和的洗脱条件毫无意义，相反是非常有用的，只不过这些措施都不能完全避免蛋白质的变性。
2.渗漏
      亲和色谱的第二个问题是生物亲和配体和杂质的渗漏。渗漏现象很隐蔽却十分严重。正是由于渗漏现象，美国食品药物管理局（FDA）要求用于生产生物活性物质的亲和配体与生产的终产物使用相同的申请标准，甚至到控制亲和配体的纯化过程。例如常用于亲和色谱的Protein A，由固定了人类单抗IgG的亲和色谱纯化。IgG色谱柱可能含有病毒，如果渗漏到纯化的Protein A中，病毒就有可能进入到纯化终产物。即使彻底控制了病毒的污染，却还有一个问题：Protein A来源于致病菌，有含有有害杂质的危险。有些色谱介质生产厂家用重组的非致病菌专门生产Protein A来解决这个问题，并用非生物学方法纯化Protein A。
      如果自己制备单抗色谱柱来纯化某个生物活性物质，产生单抗的细胞系的致病性不是主要问题，而病毒污染却是必须要处理的，也要仔细检测终产物是否含有BSA、HCP、DNA、内毒素等。
      以上所讨论的问题只是渗漏最简单的一个方面。生物活性配体本身对产物安全性和有效性的影响似乎比那些与配体同时固定的杂质更大。例如Protein A，有150多篇文献描述了它能够干扰现有的每一个免疫机制，这并不奇怪，如果不是这样反倒更令人奇怪。亲和配体对IgG（一个可以称为自然免疫轴心的分子）的影响非常大。同样其他亲和配体也是如此。亲和色谱的优势在于它能识别分子的某种特殊性质，并将此分子从其他没有这个性质的分子中分离出来。但问题也随之产生了：分子的这些特殊性质往往与其某方面功能直接相关。以抗原和抗体为例，相关的功能可能是基础的，如抗原结合功能；也可能是其他功能，如补体的固定。这就使得亲和配体有极大可能会直接干扰产物的功能，或影响分子有效性，改变生物清除率以及其他药物代谢动力学的行为。
      色谱介质生产厂家已采取措施尽量减少渗漏，有些甚至宣布已经研制出无渗漏的固定基质，但似乎不太可能。亲和基质的破坏和固定联合键的断裂只是生物活性配体渗漏来源的一小部分。渗漏的主要来源是蛋白质的酶切裂解。对于固定的抗体，常见的是Fab段或F(ab)′段断裂，裂解酶主要来源于所加的样品，如加样流入的液体，或是抗体制备时带有的。对于固定的Protein A，裂解变性严重且相当广泛，事实上目前也是无法控制的。这一点可以由配体的结构了解到：Protein A由5个紧凑的柱状的蛋白酶抗性的IgG结合域构成，并由易于被蛋白酶裂解的无规则卷曲结构连接。其他配体只出现特定断裂形式，但Protein A的5个结构全部可以断裂，而且都会渗漏。
      综上可知，除去漏出物非常重要，但问题是漏出的配体是结合在产物上的。与最初亲和柱俘获产物蛋白质一样，只要缓冲液条件允许，漏出物会很快与纯化产物再聚合。如果漏出物的分子特性与产物有较大区别，还有可能将漏出物与产物的复合物分离。例如，如果产物与阴离子交换剂结合差，而漏出物结合得很好，复合物与阴离子交换剂的结合能力就介于两者之间，可以被选择性地除去。一部分产物会因此而损失（产物是与渗漏物结合的），但这种方法通常有效。不过更常见的是，复合物的特性允许除去一部分漏出物，可除去的量不够。例如Protein A 比IgG的疏水性强，但只稍强一点。在疏水柱上洗脱产物―漏出物复合物的条件与洗脱产物的条件十分相似，要除去50％的漏出物可能会损失50％的产物。
      更有效的方法是在漏出物与产物解离条件下分离两者。例如，若有小片断的漏出物与相对大分子的产物相结合，则可以在亲和柱洗脱条件下用分子筛分离。这样做的弊端是延长了产物在变性条件下的暴露时间。阳离子交换是一种很好的替代方法：在pH足够低的条件下，大部分蛋白质可以与阳离子交换剂结合，如已知漏出物与产物解离的pH即可。只要漏出物的洗脱性质与产物有足够的差别就可以把两者分开。阳离子交换之所以优于分子筛是因为当蛋白质结合在阳离子交换剂上时，由于位阻限制，蛋白质对构象变异的抵抗能力高于相同条件下溶液中游离的蛋白质。很多蛋白质在低pH的溶液中迅速发生变性，但若阳离子柱结合后可以稳定保持几个小时，这些时间足够除去漏出物。
      如果由于某些原因不能大量除去漏出配体，仍然有必要计算漏出的量，并确认对产物安全性和有效性无不利影响的配体含量的最大值。这一步也比表面上看起来要复杂得多。如果体系内含有漏出配体，配体与产物相结合后，可能会占据抗原结合位点，导致无法根据抗原结合来准确定量。这并不仅仅是理论上的假设，而是一个已证实的现象。为了得到精确的测量值，必须建立一个标准曲线——Protein A与IgG各型、各亚型的亲和曲线。这意味着需要用与产物相同亚型的非Protein A纯化的抗体来绘制标准曲线，曲线的准确性也受Protein A不同结构域数量的构象的影响，这一点相当麻烦。为了准确起见，建立标准曲线的Protein A的构象必须与样品相同。但直接了解样品中Protein A的构象几乎没有什么可行性，除此之外还有其他的复杂性。从实际操作的角度来看，惟有将漏出的Protein A彻底地分离出来，并根据纯化Protein A的标准曲线对照求得回收的量，准确测量漏出量。
3.成本
      亲和色谱的其他缺点都很明了，但最明显的是此方法成本昂贵。对于同样的基质，购买亲和配体的价格要比离子交换剂贵7～15倍。如果自己制备亲和介质，直接的耗费是降低了，但却增加了研究的费用，最终总耗费很可能超过直接购买介质的费用。这会使整个纯化过程的成本增加。有资料证明：一步亲和纯化单位量蛋白质的成本要比两步离子交换法纯化高9倍。若产物在体内使用，为了除去漏出物和其他杂质还需额外的纯化步骤，成本会更高。使用寿命逐渐降低是生物亲和介质的另一个局限性，同时也是一个增加成本的因素。大部分亲和介质不能耐受用非生物性物质清洗和消毒的条件。即便可以耐受，也只能有限地循环使用几次。很多亲和介质还会在进料时发生生物变性，如上文提到的Protein A就十分容易被裂解，尤其是在正常加样pH中性偏碱的条件下。虽然亲和介质最初制备和更换的费用已经相当高，但这与随产物变性和配体渗漏而来的检测认证费用相比仍是微不足道的。
   上述这些问题并不说明应该尽量避免使用亲和色谱，这只是提醒读者在进行表面上看似简便的亲和色谱时，仍要了解亲和色谱对产物安全性和有效性的潜在影响，了解它需要技术上的研究——既要控制变性又要除去渗漏物，并考虑由以上因素引起的检测费用。总体而言，在纯化过程中加入亲和色谱操作，如果纯化效果明显优于其他非亲和方法，则它可作为候选方法之一。

[ Last edited by xiehe_ai on 2012-6-2 at 23:22 ]

回复此楼