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转染实验要注意的一些问题
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转自 尚尚的博客 http://blog.sina.com.cn/shanghuiqing 转染实验要注意的一些问题之一 转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。 很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。 DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。外源基因整合的几率很小，要获得稳定转染的细胞株，通常需要有筛选标记（比如抗性基因）共同转染，通过选择压力维持表达的稳定——不行的统统枪毙了。质粒整合到染色体上本来就是件稀罕事儿，平均万分之一的几率，如果是线性化DNA转染，那整合的几率就高多了。不过怎么整合也就是一个或者有限的几个拷贝，所以表达量往往比较不高的。但是，“压倒一切的是'稳定'”，很多时候，转染后往往要进行稳定表达的筛选。 成功转染第一步：细胞培养注意事项 细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要，有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞，通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法；而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素，姑且不论。不过因为受限于特定的细胞，如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法，照做可也。如果是个新来的细胞株，最好查查资料看哪些成功转染案例。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，看看其中是否有你的新对手——这个FuGENE 6 比较有优势，已有750多种细胞系成功转染的资料可供参考。 当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢？ 一、健康而茁壮成长的细胞 转染前细胞最好经过1—2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。 大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率）。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。 二、恰到好处的铺板密度 转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。 不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。需要特别注意。 三、温暖舒适的培养基 健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性，需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。 血清 血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清的。这些方便好用、可在有血清条件下转染的试剂包括前面介绍的Lipofectamine2000，FuGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等。最厉害的是Qiagen的2个产品，Polyfect和Effectene，全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，包括稀释步骤，不用担心培养基的变化对细胞生长有什么不良影响了。这样，就不再需要在转染前多次洗细胞，也就减少操作的复杂程度，更重要的是不必再让细胞处于无血清的“悲惨环境”中转染，不必担心对血清缺乏很敏感的细胞受到不必要的麻烦了。娇贵的细胞们，你们有福了。不过要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。 抗生素 支原体、细菌、真菌污染，无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”，可能会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。所以，对于选择Lipofectamine2000系列转染试剂的实验，要特别注意在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。这里又要表扬Qiagen的2个产品，Polyfect和Effectene，因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，很方便的。对于筛选稳定表达株，要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。 其他添加物如抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖这些物质的存在可能会干扰DNA和转染试剂形成复合物的过程，要尽量避免。 转染实验要注意的一些问题之二 一、质粒的构建：启动子的选择 启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。 启动子可分为2大类：诱导型启动子是比较精明的，平时歇着，一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。而组成型启动子比较老实的，就是从头到尾不停干活从不闲着的那种——比如我们很熟悉的CMV启动子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK启动子啊等等。 获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。在BHK-21中，CMV启动子活性比其他启动子如SV40和RSV都要高。但这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。 一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的，但是对于转染本身来说却不一定好——因为任何持续过高表达外源基因都可能带来某种程度的细胞毒性，影响细胞生长——如果外源基因本身对细胞生长有毒，那更完蛋了，你很可能筛不到转染成功的细胞株，更别提稳定转染了——因为过量表达本身可能已经害死了那个转染了的细胞，没转染的细胞又死于筛选压力。这种时候一个不那么“能干”的启动子可能更适合一些。如果你曾经遇到原因不明的转染失败案例，会不会是这个原因呢？过犹不及就是这个道理咯。 诱导型启动子对于转染来说，特别是稳定转染，可能是更好的选择。它使得目的基因的表达可以受到我们的调控——转染的时候不表达，筛选稳定表达株后再诱导表达，使得表达有毒性的基因或者精确分析表达产物的生物学效应成为可能。多数诱导型启动子在接受某种信号后“打开开关”开始工作，也有的相反，在缺失某种信号后打开开关。Clontech还有个诱导系统是“剂量依赖的”，就是说不单表达开关可控，表达量多少也可以通过诱导剂的量来调控。还有一种特殊的启动子很好玩——具有时序性或者组织特异性（空间特异性），会受到特定的元件调控，在一定的时间或者特定组织细胞中表达的，比如那个转基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺细胞中表达的启动子——有人说这是组成型的，我觉得应该是诱导型的，只不过诱导的因素我们不知道罢了，这类启动子在不同的细胞中会有不同的表现，需要注意。诱导系统的问题主要是本底表达，表达量有限，以及诱导剂本身对细胞的影响和如何清除。 转染DNA的启动子-增强子如果不被宿主细胞识别也会产生无法表达的“悲剧”，这是实验设计时需要注意的问题。不过现在利用现成试剂盒或者模拟国外已经成功的实验的居多，独立构建表达系统的极少，因而这种问题遇到的几率也几乎可以忽略不计。 目的基因：这个对于研究人员来说是目的，因而没有选择的余地。如果你的目的基因正好会影响选定细胞株的生长，甚至有毒，那最好选择一个诱导型的启动子，不然你可能总是转染不了。但是通常在实验之前我们不清楚我们研究的基因产物是否对选定的细胞有毒，所以正负对照很重要。当排除其他原因后转染总是失败，应当从根本上考虑原因。 二、质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。 纯化质粒的质量无疑会影响转染效率。哺乳动物细胞总归是比大肠杆菌娇气，转染难度高些，因而要求的DNA纯度要更高些。早年要做转染真是大阵仗啊，光是提质粒做超离就令人皱眉。最令人头疼的是内毒素了。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的类脂A（lipopolysaccharides），在细菌被裂解时被释放出来，由于其化学结构和特性，在质粒提取的过程中内毒素很容易混入质粒DNA中共同纯化出来。内毒素的存在会严重地影响转染效率，此外内毒素可能会激活造血细胞（例如B细胞、巨嗜细胞等）的非特异免疫反应，造成实验中的假阳性。所以质粒DNA转染时应尽量采用无内毒素污染的超纯质粒。幸好技术的进步令复杂的操作成为过去，多数实验室会选择使用转染级别的质粒纯化试剂盒纯化的质粒来转染。对于一些“耐受性高、容易操作的”细胞株，普通的Kit已经够了。对于一些对内毒素特别敏感的细胞，就要用“去内毒素”的质粒纯化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相当于2次CsCl超速离心纯度的质粒，同时特别设计去除内毒素，专为最娇气的细胞系转染和体内DNA疫苗而设计。此外现在Invitrogen和Stratagene都有一些快速纯化质粒同时也去内毒素的Kit，使得去除质粒中的内毒素更为简便。 质粒DNA的浓度和量：既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。有的初学者习惯按照说明书123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否还“知其所以然”呢？DNA:转染试剂的比例的优化是非常重要的，特别是对于阳离子脂质体、多胺等带电荷的转染试剂来说，DNA-转染复合物所带的净电荷是由转染试剂和DNA的比例决定的，而转染复合物是否能更好地结合到带负电的细胞膜上，很大程度取决于这个净电荷。所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA，比如Effectene只需要常规五分之一的DNA。所以转染前最好能精确定量质粒。另外由于质粒本身的因素（比如目的基因产物是否有毒、启动子强弱等因素），单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响，所以同时做几组不同量的对照实验进行优化是很有帮助的。另外值得注意的是，当细胞铺板密度较高时，需要的质粒DNA和转染试剂的量也会略微提高。 转染实验中要注意的一些问题之三 不同的实验技术都是为了满足不同的实验需要，RNA转染提供了另一种有别于DNA转染的研究探索手段——直接将体外翻译的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖体利用转染技术带入细胞中。由于不需要经过转录即可直接翻译，RNA转染得到的结果比DNA转染更快更直接，当然仅限于瞬时表达。RNA转染的这些特性很适合某些研究：比如处于非分裂期的细胞转染或者很难用质粒转染的细胞，RNA病毒的研究，反义RNA的转染，siRNA转染（RNA干扰）等等。 哪些因素影响RNA转染的效率？ 既然都是核酸，传统的DNA转染方法都可以用来转染RNA，不过最头疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。 RNA操作要注意的事项我们就不用罗嗦了，转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，你也要想到人家做质粒DNA转染时往往不会这么小心，难免将污染混入，那你岂不是很冤？多数情况下转染试剂都不建议自己分装，因为不同的管材可能会影响转染试剂的稳定性，那就更得不偿失了。所以RNA专用的转染试剂会更好一些。还有重要的一点就是要采用优质无RNAse污染的血清。 转染时的细胞汇合度常常会比DNA转染高一点，也许是因为RNA转染表达比DNA快？RNA转染的用量必须参考转染试剂说明，因为RNA和转染试剂的比例决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA少了固然表达不好，太多也会有毒性的问题。有的品牌转染试剂有促核酸凝聚的试剂，帮助核酸折叠为较为致密的结构。如果转染试剂对细胞没有太大影响，转染复合物和细胞共同孵育的时间越长当然越好。不过，如果RNA本身带有荧光标记的化，检测前通常要洗掉多余的RNA以免干扰结果。 除了操作，RNA本身的结构也对转染有一定的影响。哺乳动物的mRNA分子带有5'端帽子结构和3'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES（internal ribosomal entry site）的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性，或者有助于核糖体结合到mRNA上进行翻译。对于体外转录得到RNA可以通过实验加入模拟RNA5'端帽子结构类似物而获得这个保护性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通过实验添加。多数情况下添加这些元件有助于提高RNA进入细胞后的稳定性。但是有时候IRES元件促进翻译的进行，而到有的细胞株中，由于缺乏相应的结合蛋白，IRES反而影响转录。这个在RNA转染实验设计中是要格外注意的。RNA干扰实验中的siRNA结构对基因沉默效果也有影响，比如推荐添加的AA(N19)TT结构（AA(N21)或者CA(N21)也是可以的）。这就不在转染的讨论范围内了。 Oligo转染 反义寡核苷酸一度曾经是制药领域的希望之光。Oligo的转染还是属于DNA转染，由于分子小，转染的主要问题是转染后的稳定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo稳定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何选择就要根据实验目的而定了。 我们终于结束了转染这一部分。希望对你有所帮助。最后我们再顺带介绍通常在转染时遇到问题该如何面对——毕竟不同的细胞和不同的实验目的，遇到困难往往是难于预料的，所以无论前人是否已经为你提供了现成的方法，如果是除初次尝试某种试剂或者某种细胞系，这几个对照是一定要做的：空白对照，只加一定量核酸的对照，只加一定量转染试剂的对照，2个以上不同的量比实验，对于检查问题是非常有用的。 转染效率低：可能的原因： 转染试剂不适合（比如空白对照的细胞存活率就低等等） 转染试剂和核酸或者蛋白的量不够，或者比例不对（自行调整咯，别告诉我你不会） 基因表达时间（检测时间）有问题（孵育更长时间吧，如果没有毒性问题的化，如果毒性也随转染效率提高，那就要缩小孵育时间拉） 副作用（比如目的基因的毒性）（换诱导型启动子吧） 核酸或者蛋白质量问题（重做纯化实验） 报告基因或者检测系统的问题 细胞死亡率高： 过量的转染试剂或者转染复合物（减少用量或者减少孵育时间，转染后洗细胞） 细胞问题（重新复苏活化一个细胞株，或者重新传代） 目的基因毒性（减少用量） 转染效率重复性差： 细胞汇合度不同（保证同样的接种量同样的时间） 支原体污染（杀了它吧，重新复苏一管新的） 细胞传代次数太高了（重新复苏一管新的细胞） 血清质量不稳定（一次囤积同一批号的血清） |
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