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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » RAW264.7复苏细胞不贴壁 生长缓慢是怎么回事？
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W格子

新虫 (初入文坛)

[求助] RAW264.7复苏细胞不贴壁 生长缓慢是怎么回事？ 已有9人参与

我的细胞染菌了，重新复苏了一管。结果培养了一天，只有稀稀落落的很少量的细胞贴壁了，这是细胞死了的意思吗？
我寻思可能那些未贴壁的也不会再贴壁了，就换了液（含10%FBS的DMEM培养基），继续培养了，希望贴壁的那点儿能长起来。现在已经继续培养了两天了，看着好像比第一天多了一点点，有些是一坨坨的，有些是单个零星的分布着，但是仍然非常少。各位前辈遇到过这情况吗？我这可能是什么原因导致的呢？细胞还有希望长起来？我尝试再换液含20%血清的培养基养一下行吗？
急求指导~~  非常感谢~~
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1楼 2014-07-23 12:30:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

张李云

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 那个 at 2014-07-23 12:44:09
慢慢等一下吧
只要没染菌，慢慢养着吧，就别老折腾它们了。

同意，前一阵子，我养的Raw 264.7的时候也遇到同样的问题，稀疏，生长缓慢，都想放弃了，于是有四五天没管他们，结果反而长满了。柳暗花明的感觉。
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科研之路不平坦……
12楼2014-07-25 10:51:44
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一旺百旺

新虫 (著名写手)
首先看看细胞密度，包括没有贴壁的，大概知道你冻存的时候是不是细胞密度太低。如果太低状态不好也正常，细胞生长有一定的密度，要不生长很慢。到最后细胞状态可能也不会太好。复苏大约五个小时以后就要看看细胞状态，该加血清加血清，该换液就换液。很大程度上你冻的时候没有冻好，比如消化的时间不对，还有复苏的时候离心转速，还有复苏的时候可以用培养液离心两次来清洗。

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11楼2014-07-25 10:08:59
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袁1231

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
W格子: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-07-24 23:08:32
因为你的细胞太稀了，所以长的一团团的，这个长好了传下一代密度大些，我一般都是1:5。你冻存的时候估计没冻好，所以复苏不行，可以把两管放到一瓶复苏。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2014-07-24 04:05:31
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galans520wt

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

建议楼主用心点吧！我刚复苏的细胞，前2天都是抱团的！这里一堆，哪里一堆！死气沉沉！建议少晃动、移动！
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23楼2015-12-25 21:57:19
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普通回帖

那个

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
W格子: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-07-23 22:43:02
慢慢等一下吧
只要没染菌，慢慢养着吧，就别老折腾它们了。
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俺们中心提供各种分析测试，iso品质，有需要站内哈~~~~
2楼2014-07-23 12:44:09
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W格子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 那个 at 2014-07-23 12:44:09
慢慢等一下吧
只要没染菌，慢慢养着吧，就别老折腾它们了。

好的吧  谢谢你
就是很害怕它长不起来了
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3楼2014-07-23 22:42:36
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
W格子: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-07-24 23:09:10
首先确定你的培养条件没有问题，培养基里改加的都加了，培养基和血清都是合格的牌子和批次
然后确定你拿来复苏的细胞没有问题
再看看你的培养条件，二氧化碳还有吗，培养箱的水槽还有水吗，培养箱温度控制对不对，等等
如果一切都没问题，那就慢慢养吧
不需要换20%的
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4楼2014-07-24 00:25:42
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W格子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 袁1231 at 2014-07-24 04:05:31
因为你的细胞太稀了，所以长的一团团的，这个长好了传下一代密度大些，我一般都是1:5。你冻存的时候估计没冻好，所以复苏不行，可以把两管放到一瓶复苏。

嗯 的确是特别稀。 刚复苏的时候都不贴壁，就留下零星的一点细胞坚强的长着~   
我不知道是不是我冻存的时候在4℃和-20℃放的时间太长了，分别都有1h吧，对细胞有影响了？之后是-80℃12h，然后转入液氮罐。
冻存液是按细胞中心给的说明配的：常规培养液（含1%双抗）+20%FBS+8%DMSO。
今天去看了一下，好像是长了点，但是仍然很慢
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6楼2014-07-24 23:08:08
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W格子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-07-24 00:25:42
首先确定你的培养条件没有问题，培养基里改加的都加了，培养基和血清都是合格的牌子和批次
然后确定你拿来复苏的细胞没有问题
再看看你的培养条件，二氧化碳还有吗，培养箱的水槽还有水吗，培养箱温度控制对不对， ...

培养条件跟之前养的时候一样，应该是没什么问题。听大家给分析的我觉得有可能的确是我没冻存好。
请问您做的时候冻存步骤是怎样的？有哪些特别关键的细节需要注意？
3Q~
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7楼2014-07-24 23:11:14
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袁1231

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
W格子: 金币+3, ★有帮助 2014-07-25 13:07:38
引用回帖:
6楼: Originally posted by W格子 at 2014-07-24 23:08:08
嗯 的确是特别稀。 刚复苏的时候都不贴壁，就留下零星的一点细胞坚强的长着~   
我不知道是不是我冻存的时候在4℃和-20℃放的时间太长了，分别都有1h吧，对细胞有影响了？之后是-80℃12h，然后转入液氮罐。
冻存 ...

我也不知道是不是这个过程，也可能是你复苏的过程，复苏的时候要快，冻的时候要慢。美国这边有一种盒子，里面装异丙醇，然后放-80度，就是匀速降温了。
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8楼2014-07-25 06:29:06
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
W格子: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-07-25 12:53:36
细胞冻存效果不好，大部分细胞不能复苏。少量细胞存活需要时间慢慢长起来，耐心等待吧。应该没有什么问题。

至于冻存细胞，我这里非常简单：用含10% DMSO全血清冻存，也不需要逐步降温的复杂过程，就是把细胞放在特制的冻存盒或者泡沫盒内，扔到-80C冰箱了事。我的细胞从来不放在液氮中，都是存在-80C冰箱，短则三年五年，长则十年以上，好像都不存在问题。
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9楼2014-07-25 09:48:24
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zszhxmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 袁1231 at 2014-07-24 04:05:31
因为你的细胞太稀了，所以长的一团团的，这个长好了传下一代密度大些，我一般都是1:5。你冻存的时候估计没冻好，所以复苏不行，可以把两管放到一瓶复苏。

关于RAW264.7我之前培养的时候确实碰到这个问题，如果传代密度低的话，这个细胞的生长状态就不太好！
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能力满足得了欲望的时候再开口~
10楼2014-07-25 09:52:48
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