【答案】应助回帖

» 猜你喜欢

胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有259人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复
推荐一些基础有机化学的实验教程已经有0人回复
探秘高分子世界：链动微观，筑就材料新篇已经有0人回复
科研赋能时尚宠物：检测护航，焕新养宠体验已经有0人回复
精测粗蛋白：以科研标尺，守品质核心已经有0人回复
解码碳水世界：科研探秘，赋能营养与应用已经有0人回复
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石已经有0人回复
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例已经有0人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

急求，pcr扩增cDNA时扩增出了基因组的片段。接下来该怎么办。已经有4人回复

1楼2014-07-22 14:36:30

回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

应助: 72 (初中生)
金币: 1513.9
红花: 7
帖子: 202
在线: 164.5小时
虫号: 1952690
注册: 2012-08-23
性别: MM
专业: 理论法学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-22 18:18:16

两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃

赞一下(2人)

rainwater

2楼2014-07-22 16:40:46

usky_4

银虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 34 (小学生)
金币: 353.4
红花: 3
帖子: 65
在线: 24小时
虫号: 3333607
注册: 2014-07-22
性别: GG
专业: 造血干细胞移植

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:43:23

1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长？不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少？如果间隔较长，可以查一下看看是不是这段序列会形成二级结构使得扩增无法进行。
500ng的模板浓度的确有点高，但应该不会是个问题，可以试着降低一下浓度。
退火温度可以做个梯度试试。

赞一下(1人)

下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧

5楼2014-07-22 18:46:14

普通回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 41.5
帖子: 8
在线: 7.4小时
虫号: 1776950
注册: 2012-04-24
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了

3楼2014-07-22 17:06:38

luwei13566

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
应助: 184 (高中生)
金币: 4334.9
散金: 97
红花: 35
帖子: 641
在线: 261.1小时
虫号: 2380655
注册: 2013-03-27
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

引用回帖:

3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。

大家相互帮助哈

4楼2014-07-22 18:20:38

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 41.5
帖子: 8
在线: 7.4小时
虫号: 1776950
注册: 2012-04-24
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

5楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 18:46:14
1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长？不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少？如果间隔较长，可以查 ...

用的是全式金的Pfu，延伸时间为1min20s，应该足够了呀！
前半段和后半段紧挨着，不存在二级结构的问题。
退火温度试过54、55、56、57、59都不行，引物合成报告单返回来的是57.6和57.9，我再试试吧。
非常感谢！

6楼2014-07-22 19:08:42

usky_4

银虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 34 (小学生)
金币: 353.4
红花: 3
帖子: 65
在线: 24小时
虫号: 3333607
注册: 2014-07-22
性别: GG
专业: 造血干细胞移植

引用回帖:

6楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 19:08:42
用的是全式金的Pfu，延伸时间为1min20s，应该足够了呀！
前半段和后半段紧挨着，不存在二级结构的问题。
退火温度试过54、55、56、57、59都不行，引物合成报告单返回来的是57.6和57.9，我再试试吧。
非常感谢！...

Pfu其实远不如Pfx好用，尤其你的片段GC富集的话。你可以试着把延伸时间延长到2min。