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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!! 已有1人参与

最近从白念基因组上扩增一个约1.7k的片段(ORF1320bp+UTR376bp),前半段和后半段都能P出来,但是用两端引物扩增整个片段怎么都扩不出来,试过退火温度换过聚合酶也都P不出来,请大家帮忙看看问题出在哪,谢谢!

基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!!
2014-07-22-V4FL.jpg
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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 19:16:35
Pfu其实远不如Pfx好用,尤其你的片段GC富集的话。你可以试着把延伸时间延长到2min。...

好的,谢谢啦
8楼2014-07-22 19:17:24
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-22 18:18:16
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃
rainwater
2楼2014-07-22 16:40:46
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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了
3楼2014-07-22 17:06:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。
大家相互帮助哈
4楼2014-07-22 18:20:38
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