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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！
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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！ 已有1人参与

最近从白念基因组上扩增一个约1.7k的片段（ORF1320bp+UTR376bp），前半段和后半段都能P出来，但是用两端引物扩增整个片段怎么都扩不出来，试过退火温度换过聚合酶也都P不出来，请大家帮忙看看问题出在哪，谢谢！

基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！
2014-07-22-V4FL.jpg
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1楼 2014-07-22 14:36:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-22 18:18:16
两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃
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rainwater
2楼2014-07-22 16:40:46
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:43:23
1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长？不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少？如果间隔较长，可以查一下看看是不是这段序列会形成二级结构使得扩增无法进行。
500ng的模板浓度的确有点高，但应该不会是个问题，可以试着降低一下浓度。
退火温度可以做个梯度试试。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
5楼2014-07-22 18:46:14
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普通回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了
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3楼2014-07-22 17:06:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-22 18:20:38
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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 18:46:14
1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长？不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少？如果间隔较长，可以查 ...

用的是全式金的Pfu，延伸时间为1min20s，应该足够了呀！
前半段和后半段紧挨着，不存在二级结构的问题。
退火温度试过54、55、56、57、59都不行，引物合成报告单返回来的是57.6和57.9，我再试试吧。
非常感谢！
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6楼2014-07-22 19:08:42
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usky_4

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 19:08:42
用的是全式金的Pfu，延伸时间为1min20s，应该足够了呀！
前半段和后半段紧挨着，不存在二级结构的问题。
退火温度试过54、55、56、57、59都不行，引物合成报告单返回来的是57.6和57.9，我再试试吧。
非常感谢！...

Pfu其实远不如Pfx好用，尤其你的片段GC富集的话。你可以试着把延伸时间延长到2min。
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huihuisdnu
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
7楼2014-07-22 19:16:35
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huihuisdnu

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 19:16:35
Pfu其实远不如Pfx好用，尤其你的片段GC富集的话。你可以试着把延伸时间延长到2min。...

好的，谢谢啦
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8楼2014-07-22 19:17:24
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了...

gDNA浓度确实有点高，25 ul体系100 ng的量就够了，不过模板浓度高点也不至于扩增不出来，顶多有些非特异性扩增。
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rainwater
9楼2014-07-23 08:48:37
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杨仔

铁虫 (初入文坛)
白色念球菌不是真核吗？基因组没有内含子吗？
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10楼2014-07-25 17:28:36
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