24小时热门版块排行榜    

查看: 2807  |  回复: 11
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!! 已有1人参与

最近从白念基因组上扩增一个约1.7k的片段(ORF1320bp+UTR376bp),前半段和后半段都能P出来,但是用两端引物扩增整个片段怎么都扩不出来,试过退火温度换过聚合酶也都P不出来,请大家帮忙看看问题出在哪,谢谢!

基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!!
2014-07-22-V4FL.jpg
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了...

gDNA浓度确实有点高,25 ul体系100 ng的量就够了,不过模板浓度高点也不至于扩增不出来,顶多有些非特异性扩增。
rainwater
9楼2014-07-23 08:48:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-22 18:18:16
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃
rainwater
2楼2014-07-22 16:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了
3楼2014-07-22 17:06:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。
大家相互帮助哈
4楼2014-07-22 18:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +3 启萌科技 2026-08-12 11/550 2026-08-13 22:57 by 启萌科技
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 关于代码变化问题,想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
信息提示
请填处理意见