24小时热门版块排行榜    

查看: 2804  |  回复: 11
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!! 已有1人参与

最近从白念基因组上扩增一个约1.7k的片段(ORF1320bp+UTR376bp),前半段和后半段都能P出来,但是用两端引物扩增整个片段怎么都扩不出来,试过退火温度换过聚合酶也都P不出来,请大家帮忙看看问题出在哪,谢谢!

基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来!!!
2014-07-22-V4FL.jpg
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 18:46:14
1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长?不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少?如果间隔较长,可以查 ...

用的是全式金的Pfu,延伸时间为1min20s,应该足够了呀!
前半段和后半段紧挨着,不存在二级结构的问题。
退火温度试过54、55、56、57、59都不行,引物合成报告单返回来的是57.6和57.9,我再试试吧。
非常感谢!
6楼2014-07-22 19:08:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-22 18:18:16
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃
rainwater
2楼2014-07-22 16:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确,一定选择正反向引物;另外,分析一下两端引物的Tm值,引物之间是否形成引物二聚体,Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了
3楼2014-07-22 17:06:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题,这两个大引物Tm只差0.3度,也没有形成二聚体,各个引物自身也没有发夹结构,他们说有一种可能是模板浓度的问题,现在用的是25ul体系500ng gDNA,是不是太高了?可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。
大家相互帮助哈
4楼2014-07-22 18:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 不应该看fileCode +5 且听虎啸 2026-08-12 6/300 2026-08-12 16:26 by Tide man
[基金申请] FileCode能看出啥? +8 要乐观耀哥 2026-08-10 21/1050 2026-08-12 16:08 by 云上清扬
[基金申请] 长年满屏的广告,版主太不责任了。基金也等的急 +4 gltch 2026-08-12 4/200 2026-08-12 16:08 by eulota
[基金申请] filecode +13 documentary 2026-08-10 15/750 2026-08-12 15:56 by 云上清扬
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 35/1750 2026-08-12 14:38 by sdfapple719
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +4 工厂打螺丝 2026-08-08 4/200 2026-08-12 09:18 by hansi2025
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 听说今天filecode变了 +26 布布和一二 2026-08-06 49/2450 2026-08-11 13:18 by WH3796
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 13/650 2026-08-11 09:49 by 家与远方
[基金申请] 基金中了 +15 laoda193707 2026-08-06 15/750 2026-08-11 00:11 by jiafei2190
[基金申请] 关于代码变化问题,想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
信息提示
请填处理意见