应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！
51/1返回列表
查看: 2787  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！ 已有1人参与

最近从白念基因组上扩增一个约1.7k的片段（ORF1320bp+UTR376bp），前半段和后半段都能P出来，但是用两端引物扩增整个片段怎么都扩不出来，试过退火温度换过聚合酶也都P不出来，请大家帮忙看看问题出在哪，谢谢！

基因组中扩增1.7k片段怎么都P不出来！！！
2014-07-22-V4FL.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-22 14:36:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huihuisdnu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-22 16:40:46
两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃

引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-22 17:06:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-22 18:18:16
两端引物的选择是否正确，一定选择正反向引物；另外，分析一下两端引物的Tm值，引物之间是否形成引物二聚体，Tm值的差别不能超过5℃
赞一下(2人) 回复此楼
rainwater
2楼2014-07-22 16:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huihuisdnu at 2014-07-22 17:06:38
引物选择没问题，这两个大引物Tm只差0.3度，也没有形成二聚体，各个引物自身也没有发夹结构，他们说有一种可能是模板浓度的问题，现在用的是25ul体系500ng gDNA，是不是太高了？可是前半段和后半段扩出来了...

25ul 500ng确实高了。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2014-07-22 18:20:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:43:23
1.7k应该很容易就能扩增出来。Extension的时间是否够长？不同聚合酶有不同的阅读速度。一般的酶都是1kbp/min左右。可以试着延长Extension时间。
你所扩增出来的前半段和后半段之间间隔有多少？如果间隔较长，可以查一下看看是不是这段序列会形成二级结构使得扩增无法进行。
500ng的模板浓度的确有点高，但应该不会是个问题，可以试着降低一下浓度。
退火温度可以做个梯度试试。
赞一下(1人) 回复此楼
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
5楼2014-07-22 18:46:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 5/250 2026-08-08 21:54 by 13586093586
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +3 布布和一二 2026-08-08 3/150 2026-08-08 18:15 by Lightingo
[基金申请] 好奇怪的filecode +3 布布和一二 2026-08-08 4/200 2026-08-08 17:46 by zhanghaozhu
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:19 by oEVWOejN9taj
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 5/250 2026-08-08 16:47 by oEVWOejN9taj
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:02 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 15:07 by oEVWOejN9taj
[基金申请] fileCode有新解读？ +9 Tide man 2026-08-08 17/850 2026-08-08 14:56 by archvillain
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:27 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:22 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:01 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭