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zxlulurain

新虫 (初入文坛)

[求助] CHIP超声条件请各位做过的大神给点建议 已有3人参与

刚刚开始做chip，实验室是sonics VCX130超声破碎仪，探头是2mm的，要破碎的体积大约是200-400ul，细胞是sw1990和panc-1，请各位做过chip的虫友们给出点点子，超声破碎的条件多少功率，冲击几秒，间歇几秒，几个循环比较合理，可以破碎到所需要的DNA片段。
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1楼 2014-06-18 11:32:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wallen379

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+10, 应助指数+1 2014-07-15 21:56:18
gyesang: MolEPI+1, good ! 2014-07-15 21:56:34
做ChIP第一步就是去确定超声的条件，这个具体超声参数肯定是需要自己去摸索的，因为每个人不同的机器和材料以及溶剂就有不同的方法。
以下是我个人总结的一些超声需要注意的事项：
1.片段长度，如果是只做ChIP-PCR的话在200-1000范围内都可以，因为这个长度便于扩增，而ChIP-seq就得在200-500之间，这个范围便于测序。
2.超声功率，你需要做几个梯度（如10%-60%，或100W-400W），从小到大去测试，太小不能充分打断，太大则过度打断，甚至会过热、起泡。如果是宁波东芝的可能不太稳定，我用的是美国BRANSON的，很稳定，40%比较好。
3.超声时间，你需要做几个梯度（如1min-5min），这个是指总时间，不包括间隔。从短到长，道理同上，我的是4分钟。然后一次on的时间，则1s-30s不等，随你所好，关键是不要超久过度产热，会使你的蛋白变性或起泡，因为溶液里有表面活性剂SDS。我的是一次超10秒，on的总时间4分钟（不包括间隔）。
4.间隔时间，目的是让你的之前单次超神产生的热量冷却下来，10s-2min不等，一般不比on的时间短，我的是30s。
5.循环的总数，也就是超声的总时间，包括间隔，你就根据3和4自己算一下吧。
6.注意事项：a 虽然你的探头是最小的2mm，但是我建议你最好体积不要太小，否则探头容易碰壁或离开液面，散热也不够好；b 整个超声过程最好再冰水混合浴中进行，道理如前； c 我个人经验，用1.5ml的Ep管超声不易起泡。
暂时就想到这么多了，欢迎大家指正。
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5楼2014-07-02 23:59:56
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茂林修竹7

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-06-29 17:23:29
gyesang: 应助指数+1 2014-07-15 21:55:33
超声破碎的时间和功率最好自己摸索一下，超声后跑电泳，确保片段的大小集中在500bp-1kb。
根据你超声仪的参数，你可以试试10%功率，打5s停9s，打8-10次。（我的做法是，直接用手拿着，超声2次放到冰上冷一会）
一定要保证不能出现气泡，我的经验是 超声时探头位于离心管的底部，但是不能接触管壁。
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将欲取之必先与之
3楼2014-06-29 16:20:28
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by-今夕

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-15 21:55:20
gyesang: 应助指数+1 2014-07-15 21:55:27
我们这有好像是东芝牌的，300W，超2.5sec，停5sec，超了5min, 条带在300左右。之前借的仪器不知道是什么牌子，用的50%的功率，超了8sec，停30sec，超了10次都没有成功。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2014-06-29 19:57:28
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普通回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zxlulurain(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-19 09:13:31
自己动手丰衣足食
DNA片段以500 bp为主时比较合适。
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2楼2014-06-18 16:43:29
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流连客

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 茂林修竹7 at 2014-06-29 16:20:28
超声破碎的时间和功率最好自己摸索一下，超声后跑电泳，确保片段的大小集中在500bp-1kb。
根据你超声仪的参数，你可以试试10%功率，打5s停9s，打8-10次。（我的做法是，直接用手拿着，超声2次放到冰上冷一会）
一 ...

刚接触CHIP,请教个问题,为什么不能出现气泡？
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6楼2014-08-07 22:49:57
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流连客

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wallen379 at 2014-07-02 23:59:56
做ChIP第一步就是去确定超声的条件，这个具体超声参数肯定是需要自己去摸索的，因为每个人不同的机器和材料以及溶剂就有不同的方法。
以下是我个人总结的一些超声需要注意的事项：
1.片段长度，如果是只做ChIP-PC ...

请问你有没有用过covaris s220的超声仪？实验室按照200bp推荐参数总是得到100左右或100bp以下的片段。
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7楼2014-08-07 22:52:55
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fanfan3570

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 流连客 at 2014-08-07 22:52:55
请问你有没有用过covaris s220的超声仪？实验室按照200bp推荐参数总是得到100左右或100bp以下的片段。...

我们这边用的Covaris M220做的，老是打不下来，片段特别大，能问一下，你那边打断的之前样品是怎么处理的呀？甲醛交联，甘氨酸终止交联清洗干净以后的，到打断之前的。

我觉得你可以根据推荐的参数，把打断时间减小一些试一下
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8楼2014-11-12 11:50:26
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fanfan3570

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by by-今夕 at 2014-06-29 19:57:28
我们这有好像是东芝牌的，300W，超2.5sec，停5sec，超了5min, 条带在300左右。之前借的仪器不知道是什么牌子，用的50%的功率，超了8sec，停30sec，超了10次都没有成功。

我们实验室也是用的东芝的，但是一直打不下来，想问一下，你们甲醛交联，用甘氨酸终止以后，到打断之前的实验步骤能告诉我一下吗？特别是buffer的配方，我用打得是人的细胞系，想做CHIP-seq
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9楼2014-11-12 12:20:28
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xingzhikong

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wallen379 at 2014-07-02 23:59:56
做ChIP第一步就是去确定超声的条件，这个具体超声参数肯定是需要自己去摸索的，因为每个人不同的机器和材料以及溶剂就有不同的方法。
以下是我个人总结的一些超声需要注意的事项：
1.片段长度，如果是只做ChIP-PC ...

怎么，才能不起泡？我每次超声 都会起泡？？求助啊
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努力吧~~~
10楼2015-07-15 13:00:45
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