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wallen379

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+10, 应助指数+1 2014-07-15 21:56:18
gyesang: MolEPI+1, good ! 2014-07-15 21:56:34
做ChIP第一步就是去确定超声的条件,这个具体超声参数肯定是需要自己去摸索的,因为每个人不同的机器和材料以及溶剂就有不同的方法。
以下是我个人总结的一些超声需要注意的事项:
1.片段长度,如果是只做ChIP-PCR的话在200-1000范围内都可以,因为这个长度便于扩增,而ChIP-seq就得在200-500之间,这个范围便于测序。
2.超声功率,你需要做几个梯度(如10%-60%,或100W-400W),从小到大去测试,太小不能充分打断,太大则过度打断,甚至会过热、起泡。如果是宁波东芝的可能不太稳定,我用的是美国BRANSON的,很稳定,40%比较好。
3.超声时间,你需要做几个梯度(如1min-5min),这个是指总时间,不包括间隔。从短到长,道理同上,我的是4分钟。然后一次on的时间,则1s-30s不等,随你所好,关键是不要超久过度产热,会使你的蛋白变性或起泡,因为溶液里有表面活性剂SDS。我的是一次超10秒,on的总时间4分钟(不包括间隔)。
4.间隔时间,目的是让你的之前单次超神产生的热量冷却下来,10s-2min不等,一般不比on的时间短,我的是30s。
5.循环的总数,也就是超声的总时间,包括间隔,你就根据3和4自己算一下吧。
6.注意事项:a 虽然你的探头是最小的2mm,但是我建议你最好体积不要太小,否则探头容易碰壁或离开液面,散热也不够好;b 整个超声过程最好再冰水混合浴中进行,道理如前; c 我个人经验,用1.5ml的Ep管超声不易起泡。
暂时就想到这么多了,欢迎大家指正。
5楼2014-07-02 23:59:56
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